Свободнорадикальное окисление липидов и репродуктивное здоровье коров

Свободнорадикальное, или пероксидное, окисление липидов (СРО, ПОЛ) в настоящее время рассматривается как один из доминирующих метаболических процессов, которые обеспечивают регуляцию функциональной деятельности любых физиологических систем организма. Реакции пероксидного окисления носят универсальный характер, служат источником основной массы энергии, необходимой для жизнедеятельности, и показателем устойчивости метаболических превращений в организме.

Инициаторы свободнорадикального окисления — активные формы кислорода (АФК), образующиеся в оксидазных (митохондриальных) и оксигеназных (микросомальных) реакциях аэробного окисления, протекающих при участии молекулярного кислорода (О2). В процессе этих реакций О2 подвергается последовательному одновалентному восстановлению с образованием так называемых свободнорадикальных соединений, имеющих неспаренный электрон. При потере кислородом одного электрона вначале образуется супероксидный анион-радикал (О2^), который затем превращается в пергидроксильный радикал (НО/) и перекись водорода (Н2О2), последующее восстановление которой сопровождается образованием воды (Н2О) и гидроксильного радикала (ОШ). Последний отличается высокой реакционной способностью и выступает одним из основных инициаторов ПОЛ (1-4). При определенных условиях неэнзиматическая дисмутация супероксидного аниона может продуцировать синглетный кислород (1О2), обладающий, как и гидроксильный радикал, высокой реакционной и биологической активностью.

АФК вступают в реакции окисления с полиненасыщенными липидами, в том числе с жирнокислыми остатками фосфолипидов — основными структурными компонентами биологических мембран, и инициируют образование целого ряда молекулярных продуктов ПОЛ (пероксидных радикалов RO/): гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот, альдегидов и диальдегидов, кетонов, лактонов, эпоксидов, веществ типа оснований Шиффа и др. Все они играют важную роль в процессах структурной модификации биомембран и изменении их физико-химических свойств (5). Чрезмерная продукция активных форм кислорода и избыточное накопление в организме продуктов ПОЛ приводит к изменению физико-химических свойств биомембран, активности многих мембраносвязанных ферментов, нарушению проницаемости, а затем структурной целостности и генотоксическому окислительному повреждению ДНК (6).

Образование, накопление и утилизация продуктов СРО контролируется системой противоокислительной (антиоксидантной) защиты, включающей неферментативные и ферментативные звенья. Система антиоксидантной защиты (АОЗ) ограничивает процессы свободнорадикального окисления липидов практически во всех его звеньях и поддерживает этот класс реакций на относительно постоянном уровне. Она контролирует содержание в организме активных форм кислорода, свободных радикалов, молекулярных продуктов ПОЛ (5) и играет исключительную роль в поддержании гомеостаза.

В ферментном звене системы АОЗ центральное место занимает представленная медь-, цинк- и марганецсодержащими ферментами супер-оксиддисмутаза (СОД), которая катализирует реакцию дисмутации супер-оксиданион-радикала с образованием молекулярного кислорода и перекиси водорода, также способной оказывать токсическое действие на клетки. Разрушение молекул Н2О2 осуществляют ферменты каталаза и глутатионпероксидаза (8). Каталаза — гематинсодержащий фермент, разрушающий Н2О2 без участия акцепторов кислорода. Донором электронов при этом служит сама перекись водорода. Каталаза длительно сохраняет свою активность, не требует энергии активации, а скорость реакции разложения пероксида водорода лимитируется лишь скоростью диффузии субстрата к активному центру фермента. Глутатионпероксидаза, один из компонентов антиперекисного комплекса, включающего глутатион и глутатионредукта-зу, катализирует превращение пероксида водорода и гидроперекисей жирных кислот до нетоксических соединений. Эффективность глутатионпе-роксидазного механизма восстановления гидроперекисей зависит от со- держания в организме основного донора водорода — глутатиона. Поддержание достаточного количества восстановленной формы глутатиона, окисляющегося при функционировании глутатионзависимых антиперекисных систем, осуществляется ферментом глутатионредуктазой (ГР).

В неферментативном звене системы АОЗ центральное место занимают токоферолы (9), из которых наибольшей биологической активностью обладает а -токоферол (витамин Е), поступающий в организм с растительными и животными кормами. Свою антиоксидантную функцию он осуществляет за счет создания компактной мембранной архитектуры, предотвращающей атаку активных форм кислорода на ненасыщенные жирнокислотные остатки мембранных фосфолипидов, локального разрушения образующихся кислородных и липидных пероксидных радикалов. а -То-коферол служит эффективным «тушителем» синглетного кислорода, акцептором анион-радикала кислорода и «перехватчиком» свободных радикалов, непосредственно реагируя с ними на стадии обрыва цепей (10, 11).

Принято считать, что активно реагировать с пероксидными радикалами может только восстановленная (фенольная) форма витамина Е, имеющая свободную гидроксильную группу. Среди веществ, способных восстанавливать окисленную хинонную форму в фенольную и тем самым регенерировать антирадикальную активность витамина Е, важнейшее значение имеет аскорбиновая кислота, выступающая в качестве донора протонов и синергиста витамина Е (12, 13). Кроме того, она может сама взаимодействовать с синглетным кислородом, гидроксильным радикалом и супероксидным анион-радикалом, разрушать пероксид водорода (14, 15). Восстановление аскорбиновой кислоты осуществляется за счет восстановленного глутатиона. Тесная взаимосвязь аскорбиновой кислоты с токоферолом и глутатионом делает ее важным компонентом биологической неферментативной системы антиоксидантной защиты.

В работах последних лет доказано, что в реакциях окислительного стресса и в механизмах антиоксидантной защиты также принимает участие оксид азота NO • (16-22). Его защитный эффект связывают со способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов (23, 24), а также взаимодействовать с супероксиданион-радикалом и обеспечивать детоксикацию потенциально опасных активных форм кислорода (5, 17, 22).

При исходной недостаточности системы АОЗ, при снижении ее мощности из-за воздействия экстремальных внешних факторов или в силу внутренних физиологических причин отмечается выход процессов ПОЛ за регулируемые пределы, избыточное накопление его токсических продуктов, развитие окислительного стресса и свободнорадикальной патологии (1, 25, 27) со структурно-метаболическими изменениями в органах репродукции и возникновением таких заболеваний, как фетоплацентарная недостаточность, поздний токсикоз беременных, плацентиты, антенатальная гипоксия плода, задержание последа, послеродовая субинволюция матки и эндометрит (28-32), хронические патологии матки и яичников, сопровождаемые бесплодием (33-35).

Поэтому в научной литературе последних лет ведутся активные обсуждения роли ПОЛ в молекулярных механизмах адаптивных реакций и в генезе многих болезней продуктивных животных.

Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей функционирования системы пероксидное окисление липидов—антиоксидантная защита и оксида азота у высокопродуктивных молочных коров при физиологическом и патологическом течении беременности и послеродового периода.

Кровь получали из яремной вены в утренние часы. В качестве антикоагулянта использовали гепарин. В крови оценивали количество малонового диальдегида (МДА), активность глутатионпероксидазы (ГПО), глу-татионредуктазы (ГР), каталазы, супероксиддисмутазы (СОД) (36), сумму стабильных метаболитов оксида азота (NO * ) (37). Содержание витаминов Е и С определяли в сыворотке крови спектрофотометрическим методом (38), общих липидов, холестерина и триглицеридов — с помощью наборов фирм «Vital Diagnostica» (Россия) и «Lachema» (Чехия), молочной кислоты в крови — по реакции с пароксидифенилом (36).

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica v. 6.0. Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t -критерий Стьюдента.

Результаты. Патология беременности у коров, клинически проявляющаяся симптомокомплексом гестоза, развивалась на фоне активации процессов пероксидного окисления липидов при одновременном повышении активности системы антиоксидантной защиты как компенсаторной реакции на повреждающее действие продуктов ПОЛ (табл. 1).

1. Показатели системы пероксидное окисление липидов—антиоксидантная защита у коров красно-пестрой породы при физиологическом и патологическом течении беременности ( М ± m ; племзавод «Дружба», Павловский р-н, Воронежская обл.; зимне-стойловый период 2009 года)

Показатель	Клинически здоровые ( n = 9)	Гестоз в легкой форме ( n = 9)	Гестоз в тяжелой форме ( n = 9)
МДА, мкмоль/л	1,04±0,140	1,49±0,120	1,48±0,140
ГПО, ммоль GSH/(n • мин)	14,6±1,54	17,2±2,11	18,4±2,58
Каталаза, ммоль Н 2 О 2Д Л • мин)	30,1±1,26	34,4±0,93	35,3±2,44
Витамин Е, мкмоль/л	11,2±0,89	9,9±1,20	7,7±0,93
Витамин С, ммоль/л	14,5±5,73	18,1±4,02	12,0±1,69
NO * , мкмоль/л	60,1±8,02	83,0±7,87	79,3±8,19
П р и м е ч а н и е. МДА — малоновый диальдегид, ГПО		— глутатионпероксидаза, GSH — восстановлен-
ный глутатион, NO * — сумма стабильных метаболитов оксида азота.

Исходя из увеличения концентрации в крови малонового диальдегида, их количество у животных с легкой формой гестоза возрастало на 43,0 % по сравнению с таковым у здоровых коров (р < 0,05). При этом 110

активность ГПО увеличилась на 11,0 %, каталазы — на 14,3 %, содержание стабильных метаболитов NO * — на 38,0 %, витамина С — на 24,1 %. В то же время количество витамина Е, не синтезирующегося в организме, снизилось на 11,7 %, что было связано с увеличением его расхода на нейтрализацию токсических продуктов ПОЛ.

Усиление тяжести патологического процесса вызывало дальнейшее повышение активности ферментативного звена системы АОЗ и снижение — неферментативного. Активность ГПО по сравнению с клинически здоровыми животными возрастала на 26,0 %, каталазы — на 17,3 %, количество витамина Е снижалось на 33,3 % (р < 0,01), витамина С — на 17,2 %.

На фоне повышения интенсивности СРО было отмечено снижение концентрации в крови общих липидов с 4,1±0,35 до 3,1±0,18 г/л, или на 24,4 % (р < 0,05), увеличение количества триглицеридов с 0,5±0,02 до 1,1±0,04 ммоль/л, или в 2,1 раза (р < 0,001), молочной кислоты — с 1,8±0,07 до 4,5±0,13 ммоль/л, или в 2,5 раза (р < 0,001). Последнее обстоятельство свидетельствует об усилении анаэробного распада углеводов для обеспечения тканей развивающегося плода энергией в условиях недостатка кислорода, который возникает в связи с расстройством маточно-плацентарного кровообращения.

Установлено также достаточно активное ПОЛ при развитии в половых органах воспалительных процессов после родов (табл. 2). Об этом свидетельствовала высокая концентрация в крови МДА, превышающая аналогичный показатель у клинически здоровых животных на 76,0 %. Подобная тенденция была обусловлена резким увеличением нейтрофильной и макрофагальной продукции активных форм кислорода, наблюдаемой при воспалительном процессе. В то же время таким животным свойственно компенсаторное включение ферментативного звена антиоксидантной защиты. Активность ГПО крови у больных коров оказалась выше на 65,8 % (р < 0,001), ГР — на 14,6 % (р < 0,05), СОД — на 46,0 % (р < 0,001), каталазы — на 45,7 % (р < 0,001). Однако невысокий рост активности ГР по сравнению с ГПО может свидетельствовать о недостаточности функционального потенциала глутатионового звена системы АОЗ и неспособности адекватного пополнения пула восстановленного глутатиона (39).

2. Показатели системы пероксидное окисление липидов—антиоксидантная защита у коров красно-пестрой породы при физиологическом и патологическом течении послеродового периода ( М ± m ; племзавод «Дружба», Павловский р-н, Воронежская обл.; зимне-стойловый период 2009 года)

Показатель

Физиологическое течение послеродового периода ( n = 17)

Острый эндометрит ( n = 28)

Хроническая субинволюция ( n = 12)

Гипофункция яичников ( n = 12)

МДА, мкмоль/л	1,00±0,050	1,76±0,400	1,45±0,030	1,57±0,060
ГПО, ммоль GSH/Сл • мин)	9,4±0,32	15,8±0,44	13,7±0,45	12,0±0,64
ГР, мкмоль G-SS-G/Сл • мин)	293,1± 10,88	336,2±9,06	299,0±7,11	324,0±8,24
СОД, усл. ед/мг гемоглобина	0,72±0,030	1,05±0,030	0,97±0,040	0,95±0,050
Каталаза, ммоль Н 2 О2ДЛ • мин)	25,9±0,57	37,6±0,63	33,0±1,28	32,2±0,84
Витамин Е, мкмоль/л	23,7±3,48	15,3±0,93	28,3±2,79	16,2±2,78
NO * , мкмоль/л	47,8±0,29	138,7±7,14	-	20,6±2,21

П р и м е ч а н и е. МДА — малоновый диальдегид, ГПО — глутатионпероксидаза, ГР — глутатионредук-таза, СОД — супероксиддисмутаза, GSH — восстановленный глутатион, G-SS-G — окисленный глутатион, NO * — стабильные метаболиты оксида азота. Прочерк означает отсутствие данных.

Одновременно у заболевших животных отмечали снижение активности неферментативного звена АОЗ. Содержание витамина Е в их крови оказалось ниже на 35,5 % (р < 0,01). Дисбаланс в системе АОЗ не позволял поддерживать процессы ПОЛ на относительно стабильном уровне, что могло служить предпосылкой к повреждению клеточных структур эндометрия накапливающимися токсическими продуктами СРО и развитию послеродовой патологии. При этом в организме у больных коров продукция оксида азота возрастала в 2,9 раза (р < 0,01). Источником его генерации становились иммунокомпетентные клетки — макрофаги и нейтрофилы (16). Обладая антиоксидантным и миорелаксантным действием, NO\ с одной стороны, ограничивал интенсивность пероксидных реакций, с другой — угнетал сократительную деятельность матки и вызывал сбой в физиологическом течении послеродовых инволюционных процессов в половых органах.

Пероксидация липидов у коров с воспалительными заболеваниями матки сопровождалась снижением концентрации в крови общих липидов на 17,9 % (2,71±0,04 против 3,30±0,18 г/л, р < 0,001), холестерина — на 44,0 % (2,68±0,12 против 4,78±0,33 ммоль/л, р < 0,001).

Высокая активность реакций ПОЛ сохранялась у коров и при развитии хронической патологии половых органов (см. табл. 2). Так, у животных с хронической субинволюцией матки концентрация в крови МДА превышала таковую у здоровых на 45,0 %, активность ГПО — на 45,7 %, СОД — на 34,7 %, каталазы — на 27,4 % (р < 0,01-0,001). У коров с дисфункцией яичников эта разница по тем же показателям составила соответственно 57,0; 27,6; 31,9 и 24,3 % (р < 0,001). При хронической патологии матки выраженных различий по активности ГР и содержании витамина Е выявлено не было; у животных с гипофункцией половых желез активность этого фермента превышала показатель у здоровых животных на 10,5 %, а концентрация витамина Е была ниже на 31,6 %. В последнем случае коровы характеризовались низкой генерацией оксида азота. Концентрация его стабильных метаболитов в крови была ниже на 56,9 % (р < 0,001).

Исходя из того, что образование в организме NO • взаимосвязано с активностью биосинтеза половых стероидов (40, 41), падение его концентрации в крови следует отнести за счет резкого снижения гормонсинтези-рующей функции яичников. В то же время низкая продукция NO • при указанной патологии может лежать в основе нарушения генеративной функции гонад, поскольку это соединение включено в контроль секреции гипоталамусом гонадотропин-рилизинг-гормона и гипофизом лютеинизирующего гормона, ответственных за овуляторную функцию гонад (41-44).

Таким образом, активизацию свободнорадикального окисления, развитие окислительного стресса и свободнорадикальной патологии на фоне несбалансированных изменений в генерации оксида азота и глутатионовом звене антиоксидантной защиты (АОЗ) следует отнести к основным механизмам, приводящим к нарушениям репродуктивной функции у высокопродуктивных коров. Выявленные закономерности во взаимосвязи репродуктивного здоровья животных, функций системы перекисного окисления липидов-АОЗ и оксида азота могут быть использованы при разработке необходимых лечебно-профилактических мероприятий.

ФГБУ Институт геохимии и аналитической химии         Поступила в редакцию им. В.И. Вернадского РАН,                                19 марта 2014 года

2ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии,

394087 Россия, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б,

FREE RADICAL LIPID OXIDATION AND REPRODUCTIVE HEALTH OF COWS

• V.A. Safonov1, A.G. Nezhdanov2, M.I. Retsky2, S.V. Shabunin2, G.N. Bliznetsova2

• ¹V.I. Vernadskii Institute of Geochemistry and Analytical Chemistry, Russian Academy of Sciences, 19, ul. Kosygina, Moscow, 119991 Ðîññèÿ, å-mail geokhi.rus@relcom.ru ;