Свойства и филогенетическое положение бактерии Acinetobacter sp. Иб ДТ-5.1/1

ными для окружающей среды и экономически целесообразными. Особенно перспективным является метод биоремедиации, основанный на использовании высокоэффективных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, выделенных из загрязненных природных объектов. К его преимуществам кроме экологической и гигиенической безопасности относят низкую себестоимость, возможность целенаправленного применения в нужном месте в нужное время, высокую скорость усвоения и переработки микроорганизмами загрязнителей на безвредные для окружающей среды продукты жизнедеятельности бактерий. В процессе биоремедиации углерод из нефти и нефтепродуктов частично преобразуется в углекислый газ, частично переходит в биомассу клеток, и частично трансформируется в гумус и закрепляется в почве.

В связи с этим особый интерес представляют исследования, направленные на выделение и отбор наиболее активных углеводородокисляющих микроорганизмов, способных перерабатывать и утилизировать нефть и ее составляющие [7-9]. При кажущейся простоте решения данной задачи возникает ряд трудностей. Во-первых, необходимо выделить технологичные, т.е. пригодные для промышленного использования и безопасные для людей микроорганизмы; во-вторых, подобрать условия их культивирования; в-третьих, правильно выбрать время, метод и дозу внесения биодеструкторов в почву. Кроме того, необходим контроль за интегральной токсичностью почвы для гарантии безопасности продуктов разложения поллютантов и достаточной степени очистки почвы. В настоящее время в России и за рубежом разработано несколько десятков эффективных биопрепаратов-нефтедеструкторов [10-17], действие которых основано на использовании уникальных возможностей углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в их состав. Однако проблема создания новых биопрепаратов продолжает оставаться актуальной. Это связано с невозможностью унифицировать (стандартизировать) биопрепараты для различных объектов окружающей среды, видов нефтяных загрязнений, климатических условий, состава почвы и пр.

Целью работы являлся поиск, выделение из техногенной среды и описание физиологобиохимических и фенотипических свойств штамма микроорганизмов, его предварительная идентификация и исследование способности к утилизации нефти, нефтяных углеводородов и других классов органических соединений для оценки перспективности использования в качестве основы биопрепа-рата-нефтедеструктора.

Из образцов серой лесной почвы, искусственно загрязненной дизельным топливом, методом накопительных культур выделили микроорганизмы, способные использовать дизельное топливо в качестве единственного источника углерода и энергии. Для этого 1 г почвы помещали в колбы (объем 250 мл) со 100 мл жидкой минеральной среды Раймонда [18], куда вносили дизельное топливо в количестве 0,5-1% (по объему). Инкубирование проводили в лабораторном термостатируемом встряхивателе П-5.10–Э5960 при температуре 26-28°C и 160 об/мин в течение 10-14 сут при микроскопическом контроле роста микробного сообщества. Чистые культуры выделяли на агаризованной среде Раймонда, на поверхность которой наносили углеводородный субстрат – 100 мкл стерильного дизельного топлива. Культивирование микроорганизмов на чашках Петри осуществляли при температуре 30°C. Дифференциацию получившихся колоний производили по культурально-морфологическим признакам.

Чистоту выделенных культур проверяли общепринятыми методами – микроскопическим контролем и высевом на агаризованную среду МПА.

Идентифицировали чистые культуры микроорганизмов по морфологическим, физиологическим и биохимическим признакам, используя общепринятые руководства [19-21]. Определение антибиоти-кочувствительности проводили методом серийных разведений в агаре [22].

Выделение тотальной ДНК из колоний бактерий, выросших на твердой среде МПА выполняли с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб» торговой марки «АмплиСенс» (Россия) согласно рекомендациям производителя.

Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК производили с использованием бактериальных праймеров: прямого 27F (5`-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3`) и обратного

1492R (5`-АСGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3`).

Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК осуществляли с применением набора реактивов Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Ananlyzer 3500 xl (Applied Biosystems, США). Продукты секвенирования очищали с помощью набора BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США).

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК предварительно анализировали используя пакет программ EzТaxon server 2.1 (http://147.47.212.35:8080/. Далее сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с таковыми типовых штаммов близкородственных видов выполняли с помощью программы CLUSTAL W [23].

Последовательности генов 16S рРНК выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью SINA alignment service [24], согласно рекомендациям [25].

Дендрограммы выстраивали в программе MEGA версии 5 методом «присоединения ближайших соседей» (Neighbor-Joining method) [26] с использованием 2-х параметрической модели Кимура [27].

Из загрязненной дизельным топливом серой лесной почвы выделено 48 изолятов микроорганизмов. В одном из них штамм ИБ ДТ-5.1/1 по совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств был идентифицирован как Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1.

Клетки штамма представляют собой неподвижные толстые, короткие палочки, часто встречаются кокковидные одиночные или сдвоенные формы, иногда в скоплениях, размеры 0,7-1,5 х 0,7-1,0 мкм. Размножаются делением (перетяжка и перегородка).

На плотных питательных средах колонии белые, круглые, плоские, гладкие, блестящие, с ровными краями, профиль равномерно возвышающийся, диаметр 2,0-2,5 мм.

Грамотрицательные, неподвижные, аэробные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные, неспорообразующие бактерии. Не подвергают гидролизу казеин, крахмал, желатину. Не образуют сероводорода, индола и 3-кетолактозы при окислении лактозы. Потребляют цитрат и малонат. Не обладают липазной и лецитиназной активностью. Образуют кислоту из углеводов, при этом выделение газа не обнаружено. Разлагают мочевину и твин 20. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Способны переносить концентрацию NaCl не более 3% и рН среды в пределах 4,6-8,6. Максимальный рост наблюдается при рН 6,8-7,2. Растет при 10-42оС, оптимум температуры – 26-28оС.

Обладают устойчивостью к левомицетину, тетрациклину, фузидину, ванкомицину, ампициллину, бензилпенициллину. Чувствительны к ципрофлоксацину, стрептомицину, канамицину, неомицину.

В качестве единственного источника углерода и энергии используют углеводы (сахарозу, D-фруктозу, D-маннозу, D-глюкозу, D-лактозу, L-рамнозу, D-рафинозу, D-галактозу, D-мальтозу, D-ксилозу и L-арабинозу), спирты (сорбит, маннит, глицерин), аминокислоты (D-аланин, D- фенилаланин, DL-серин, DL-метионин, D-тирозин, DL-триптофан, D-валин, D-лейцин).

Утилизируют разнообразные органические вещества: нефть, углеводороды алканового ряда (декан, ундекан, тридекан), циклогексан, хлорпроиз-водные углеводородов (изобутил хлористый, этиловый эфир трихлоруксусной кислоты), ароматические соединения (бензол, толуол, о-ксилол), спирты (диэтиленгликоль, изопропиловый спирт, глицерин), кислоты (масляная, изовалериановая, капроновая). Широкий спектр деструктируемых соединений создает предпосылки для использования штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 для очистки окружающей среды от различных загрязнителей.

Для более точной идентификации бактерии проведено секвенирование и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с известными структурами из GenBank

, согласно которому с высокой долей вероятности (99,93%) можно утверждать, что изучаемый микроорганизм относится к роду Acinetobacter.

Для уточнения филогенетического положения нового штамма был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК видов, относящихся к роду Acinetobacter и построена дендрограмма (рис.). На рисунке видно, что бактерия Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, возможно, принадлежит к виду Acinetobacter calcoace-ticus .

В дальнейшем планируется изучение хемотак-сономических характеристик и уточнение видовой принадлежности штамма, а также проверка способности бактерий Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 к очистке нефтезагрязненной почвы в лабораторных и полевых условиях.

0.01

Acinetobacter baylyi B2T/AF509820

Acinetobacter soli B1T/EU290155

Acinetobacter towneri AB1110/AF509823

Acinetobacter indicus A648T/HM047743

73         Acinetobacter radioresistens DSM 6976T/AIDZ01000095

Acinetobacter gerneri 9A01T/AF509829

ч— Acinetobacter baumannii ATCC 19606T/ACQB01000091

Acinetobacter junii LMG 998T/AM410704

Acinetobacter rudis G30T/EF204258

Acinetobacter venetianus RAG-1T/AKIQ01000085

Acinetobacter bereziniae LMG 1003T/AIEI01000248

99 Acinetobacter guillouiae ATCC 11171T/X81659

Acinetobacter ursingii DSM 16037T/AIEA01000080

Acinetobacter parvus DSM 16617T/AIEB01000124

Acinetobacter tjernbergiae 7N16/AF509825

Acinetobacter beijerinckii 58aT/AJ626712

Acinetobacter haemolyticus DSM 6962T/X81662

Acinetobacter gyllenbergii 1271T/AJ293694

Acinetobacter johnsonii DSM 6963T/X81663

Acinetobacter bouvetii 4B02T/AF509827

Acinetobacter schindleri LUH5832T/AJ278311

Acinetobacter brisouii 5YN5-8T/DQ832256

Acinetobacter nosocomialis LMG 10619T/HQ180192

Acinetobacter pittii LMG 1035T/HQ180184

70 Acinetobacter sp . ИБ ДТ-5.1/1

99 Acinetobacter calcoaceticus DSM 30006T/AIEC01000170

Acinetobacter lwoffii NCTC 5866T/AIEL01000120

Psychrobacter immobilis ATCC 43116/U39399

Рис. Филогенетическое положение штамма Acinetobacter sp . ИБ ДТ-5.1/1 согласно анализу нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа (показаны величины показателя “bootstrap”-анализа выше 70%). В качестве внешней группы использована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК Psychrobacter immobilis ATCC 43116/U39399

• 1.    Гурова Т.Ф., Назаренко Л.В. Основы экологии и рационального природопользования: Учеб. пособие. М.: ОНИКС, 2005. 224 с.

• 2.    Сулейманов Р.Р., Габбасова И.М., Ситдиков Р.Н. Изменение свойств нефтезагрязнённой серой лесной почвы в процессе биологической рекультивации // Изв. РАН. Сер. биол. 2005. № 1. С. 109-115.

• 3.    Шорина Т.С., Русанов А.М., Сулейманова А.М . Влияние нефти на физические свойства чернозема обыкновенного степной зоны Урала // Вестник ОГУ. 2010. № 6. С. 137-139.

• 4.    Stroud J.L., Paton G.I., Semple K.T. Microbe-aliphatic hydrocarbon interactions in soil: implications for biodegradation and bioremediation // J. Appl. Microbiol. 2007. V. 102. N 5. P. 1239-1253.

• 5.    Давыдова С.Л., Тагасов В.И . Нефть и нефтепродукты в окружающей среде: Учеб. пособие. М.: Изд-во РУДН, 2004. 163 с.

• 6.    Сулейманов Р.Р. Изменение свойств нефтезагрязненных серых лесных почв при биологической рекультивации: Автореф. дис. … канд. с.-х. наук. Уфа, 1999. 24 с.

• 7.    Куликова И.Ю., Дзержинская И.С . Микробиологические способы ликвидации последствий аварийных разливов в море // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. 2008. № 5. С. 24-29.

• 8.    Singer A.C., van der Gast C.J., Thompson I.P. Perspectives and vision for strain selection in bioaugmentation. TRENDS in Biotechnol. 2005. V. 23. N 2. Р. 74-77.

• 9.    Thompson I.P., van der Gast C.J., Ciric L., Singer A.C . Bioaugmentation for bioremediation: the challenge of strain selection // Env. Microbiol. 2005. V. 7. N 7. Р. 909-915.

• 10.    Кисин Д. В., Колесов А. И . Препараты серии «Биодеструктор» - эффективные средства для ликвидации нефтяных загрязнений // Нефтяное хозяйство. 1995. № 5-6. С. 83-85.

• 11.    Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности: Учеб. пособие. Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001. 214 с.

• 12.    Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф. и др. Оценка эффективности нового биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2004. № 1. С. 77-82.

• 13.    Маркарова М.Ю. Опыт применения биопрепарата «Универсал» для рекультивации нефтезагрязнённых земель // Вестник Института биологии Коми НЦ УрО РАН. 2004.       №       10(84). URL:

• 14.    Булатов А.И., Волощенко Е.Ю., Кусов Г.В., Савенок О.В . Экология при строительстве и эксплуатации нефтяных и газовых скважин. Краснодар: Просвещение-Юг, 2010.

• 15.    Рогозина Е.А., Андреева О.А., Жаркова С.И., Мартынов Д.А., Орлова Н.А. Сравнительная характеристика отечественных биопрепаратов, предлагаемых для очистки почв и грунтов от загрязнения нефтью и нефтепродуктами // нефтегазовая геология. Теория и практика. 2010. Т. 5. N 3. URL: http://www.ngtp.ru/rub/7/37_2010.pdf/.

• 16.    Чертков А . Микроорганизмы-уборщики // Эксперт. 2011. № 12. С. 78.

• 17.    Murygina V., Markarova M., Kalyuzhnyi S . Application preparation «Rhoder» for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environment International. 2005. V. 31. N 2. P. 163-166.

• 18.    Raymond R.L . Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develop. Industr. Microbiol. 1961. V. 2. N 1. P. 23-32.

• 19.    Методы общей бактериологии. Т. 3 / Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1984. 264 с.

• 20.    Добровольская Т.Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий. М.: Изд-во МГУ, 1990. 76 с.

• 21.    Определитель бактерий Берджи. Т. 1, 2 / Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997.

• 22.    Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. М., 2004. 91 с.

• 23.    Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. N 22. P. 4673-4680.

• 24.    Pruesse E., Peplies J., Glöckner F.O . SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes // Bioinformatics. 2012. V. 28. N 14. Р. 1823-1829.

• 25.    Tindall B.J., Rosselló-Móra R., Busse H.J. et al. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. N 1. P. 249-266.

• 26.    Saitou N., Nei M . The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. and Evol. 1987. V. 4. N 4. P. 406-425.

• 27.    Kimura M . A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. V. 16. N 2. P. 111-120.

PROPERTIES AND PHYLOGENETIC PROVISION OF THE BACTERIUM ACINETOBACTER SP. ИБ ДТ-5.1/1

Institute of Biology, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa

From grey forest soil with diesel fuel strain Acinetobacter sp . ИБ ДТ-5.1/1 was allocated. Cultural, phenotipical, biochemical and phylogenetic features of a strain are studied. Abilities of a bacterium to utilization of oil, hydrocarbons and other organic substances of the various nature are shown.