Таксономические взаимоотношения двух видов рода Leymus hochst., на основе ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) анализа

В молекулярно-генетическом исследовании использован метод ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) для первичного скрининга генома. Метод ISSR, сравнивающий межмикросателлитные повторы последовательностей нуклеотидов, позволяет выявить генетическое разнообразие на видовом и популяционном уровне и широко используется для этих целей. Результаты анализа используются для выявления родственных отношений внутри и между таксонами, решения фило-географических вопросов.

Виды L. secalinus и L. littoralis относят в полиморфный род Leymus (Hochst.), содержащим много гибридогенных видов.

Оба вида являются многолетними, длиннокорневищными и ветроопыляемыми злакам. Систематика двух таксонов весьма запутанна и до сих пор существует неясность в современной таксономии видов, их объеме и распространении.

Объект и методы исследований

Материал для исследований был собран авторами в семи популяциях этих двух видов: 1) Китай, Внутренняя Монголия — L.sec.Ch; 2) Монголия — L.sec.Mn; 3) Россия, Бурятия, дол. р. Селенга — L.lit.BD; 4) Россия, Бурятия, окр. г. Улан-Удэ, Тулунжа — L.lit.BT; 5) Россия, Бурятия, г. Улан-Удэ — L.lit.BU; 6) Россия, Бурятия, Давша (берег оз. Байкал) — L.sec.BB; 7) Россия, Бурятия, перешеек п-ва Святой Нос (берег оз. Байкал) — L.sec.BP.

Для популяционного ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) анализа были выделены ДНК из 48 высушенных в силикагеле образцов двух видов из 7 популяций с использованием кита «Diamond» (Россия, Барнаул) в соответствии с инструкцией производителя. Ваучерные гербарные образцы хранятся в гербарии UUH. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл при ISSR-анализе содержала: 1 ед. Tag-полимеразы («Синтол»), 2.5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР («Синтол»), 20 пМ праймера, 2.5 мМ Mg2+, 0.25 мМ dNTP, 2 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере BioRad T100 (США) для ISSR-анализа по следующей программе: предварительная денатурация 94°С, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек; t° отжига, 10 сек; 72°С, 10 сек; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек; t° отжига, 5 сек; 72°С, 5 с. Последний цикл элонгации — 2 мин при 72°С. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировала от 42 до 56°С.

Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле в ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркеры молекулярной массы 1 kb DNA Ladder («Fermentas»).

На основе трех электрофореграмм (гелей) составили бинарную матрицу по присутствию и отсутствию компонента (ампликонов) для каждого из изученных образцов. Дендрограммы выполняли с использованием коэффициента «Манхэттен расстояний» (Manhattan distance) полной связи в программе STATISTICA.

Результаты и обсуждение исследований

История изучения L. secalinus и L. littoralis

Впервые L. secalinus (Georgi) Tzvel. описан И. И. Георги в 1775 г. как Triti-cum secalinum Georgi на основании долиннеевского описания и изображения вида по сборам Стеллера с песчаных берегов Байкала и с о. Ольхон, которые были опубликованы И. Г. Гмелиным в 1 т. «Flora Sibirica» [Gmelin, 1747, табл. 25]. Годом позже, в 1776 г., Паллас назвал это же растение, по тому же описанию и изображению Гмелина — Triticum littorale Pall. Типом же T. littorale Pall. является тот же рисунок И. Г. Гмелина. Е. Г. Бобров [1960] отмечает, что название, данное

И. И. Георги, является приоритетным. Здесь же Е. Г. Бобров указывает, что Ледебур в 1853 г. во «Flora Rossica» упоминает оба названных биноминала, и именно того растения, о котором шла речь у Стеллера, Гмелина, Георги и Палласа, которое квалифицировалось в качестве особой разновидности колосняка пушистоколосого — Elymus dasystachys β littoralis Griseb.ex Ledeb. Названный вид был установлен К. Триниусом в 1829 г. во «Flora Altaica» [Ledebour, 1829] с солонцов Чуи. Последующие исследователи — П. Н. Крылов, С. А. Невский, М. Г. Попов пренебрегли разновидностью Гризебаха и отнесли прибайкальское растение к виду, описанному Триниусом — Elymus dasystachys Trin. При этом Е. Г. Бобров указывает, что данный вид, по-видимому, состоит из разных рас, одной из которых является раса, населяющая пески Прибайкалья, и высказывает предположение, что изменчивость этого колосняка связана с изменениями характера его местообитания, т.е. является экологической. Кроме того, он разграничил эти виды, восстановив приоритетное название, предложенное в 1775 г. И. И. Георги — « secalinus », и предложил свою трактовку вида — Elymus secalinus (Georgi) Bobr., типом которого являлся все тот же рисунок И. Г. Гмелина в «Сибирской флоре» и классическое местонахождение вида — о. Ольхон и пески юго-западного побережья Байкала. Типом Elymus dasystachys Trin. являются растения из Чуйской долины Алтая. По Е. Г. Боброву, ареал Elymus secalinus (Georgi) Bobr., если понимать его узко — пески Прибайкалья; ареал вида в широком понимании охватывает горные области Южной Сибири и Прибайкалья, Восточного Казахстана, Киргизии и Восточного Таджикистана, Джунгарии и Монголии.

Н. Н. Цвелев указывает, что L. secalinus является очень полиморфным видом, распадающимся на несколько разновидностей, заслуживающих ранга подвидов. В своих обработках рода [Цвелев, 1968, 1976] он выделяет: L. secalinus subsp . seca-linus (Georgi) Tzvel., L. secalinus subsp. mongolicus (Meld.) Tzvel., L. secalinus subsp. pubescens (O. Fedtsch.) Tzvel., L. secalinus subsp. ovatus (Trin.) Tzvel. Здесь же он указывает, что типы Elymus dasystachys («Altai, in argilloso-salsis ad Tschuja, 1826, leg. Bunge» — LE) и E. littoralis («In arenosis ad Baikalem prope Possolskoi, 1829, Turczaninow» — LE) являются вполне типичными экземплярами L. secalinus subsp. secalinus и что тип E. littoralis (имеющий 3 изотипа) может быть избран в качестве неотипа Triticum secalinum. К числу синонимов L. secalinus Н. Н. Цвелев относит T. littorale Pall. и Elymus dasystachys Trin. [Цвелев, 1968, 1976].

Г. А. Пешкова [1987], исследовав образцы L. secalinus s.str. с классического местонахождения ( E. littoralis ) в окр. с. Посольск на юго-восточном побережье Байкала, выделила из L. secalinus (Georgi) Tzvel. L. littoralis (Griseb.) Peschkova. По мнению Г. А. Пешковой, распространение L. secalinus s.str. ограничено северным побережьем Байкала и о. Ольхон; южнее — на побережьях Байкала и в островных степях Предбайкалья, Забайкалья, Якутии, Северной Монголии — произрастает другой вид L. littoralis (Griseb.) Peschkova [Пешкова, 1990].

В новейших работах, в синопсисе рода Leymus, Йен с соавторами [Yen at al., 2009], рассматривают L. littoralis (Griseb.) Peschkova в качестве синонима L. secalinus (Georgi) Tzvel., с широким ареалом, охватывающим юго-восточные провинции Китая, Восточный Казахстан, Японию, Монголию, Восточную Сибирь России. Н. Н. Цвелев и Н. С. Пробатова [2010] при таксономической ревизии этого же рода принимают самостоятельность вида L. littoralis (Griseb.) Peschkova, ареал кото- рого охватывает Восточную Сибирь, а вне России — Монголию. Ранее Н. Н. Цвелев [1968, 1976] включал Elymus dasystachys var. littoralis Griseb.; E. littoralis (Griseb.) Turcz. ex Steud.) в L. secalinus subsp. secalinus (Georgi) Tzvel. и считал его широко распространенным видом в пустынной и степной частях Азиатского материка.

Результаты аналитических исследований

Для исследования было подобрано семь ISSR праймеров: Pr HB–14; Pr HB–12; Pr 17898B; Pr 17899A; Pr 17899B; 814; 844A c температурами отжига от 42 до 56°С. Проведены ПЦР реакции (амплификация) образцов с ISSR праймерами и получено семь гелей, из которых только три были наиболее информативными. На рисунке 1 представлен гель-электрофорез с праймера 17898В. Проведен анализ полиморфизма 42 ISSR-локусов у двух видов Leymus с трех электрофореграмм.

Рис. 1. Гель-электрофорез: ISSR вариабельность с праймера 17898B у 48 образцов видов L. secalinus, L. littoralis. Треки № 1, 33, 51 — молекулярный маркер (1500–100 п.н.). Треки № 2–11 — L. secalinus (Китай); № 12–21 — L. secalinus (Монголия, L.sec.Mn); № 22–32 — L.littoralis (дол. р. Селенга – L.lit.BD); № 34–38 — L.littoralis (окр. г. Улан-Удэ, Тулунжа — L.lit.BT); № 39–42 — L.littoralis (окр. г. Улан-Удэ, L.lit.BU);

На дендрограмме дерево разделилось на две крупные клады (рис. 2). L. seca-linus с берегов оз. Байкал образовал отдельную кладу, что указывает на его обособленность.

L. littoralis из Бурятии и L. secalinus с Монголии и Китая образовали одну большую кладу, но которая распадается на несколько субклад по географическому распространению. То что L. littoralis из Бурятии и L. secalinus из Монголии и Китая образовали единую кладу, указывает на их близкое родство и что это, возможно, один вид. Из этого следует, что название таксона — L. secalinus (Georgi) Tzvel. относится только к байкальским популяциям, а китайские и монгольские следует отнести к L. littoralis (Griseb.) Peschkova .

Наши исследования подтверждают мнение Г. А. Пешковой (1987), что распространение L. secalinus ограничено северным побережьем оз. Байкал и вид является эндемиком его побережий, южнее — на побережьях Байкала и в островных степях Предбайкалья Бурятии и Якутии произрастает L. littoralis . Результаты изучения подтвердили ранее проведенные исследования, основанные на сравнении отсеквенированных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1–5.8S-ITS2 ядерной ДНК, и показали, что ареал вида L. littoralis более обширен и охватывает Восточную Сибирь России, Внутреннюю Монголию Китая и Монголию.

Рис. 2. Дендрограмма, построенная на основе матрицы генетических расстояний между популяциями двух видов L. secalinus и L. littoralis

Заключение

В результате молекулярно-генетического анализа методом ISSR получены данные о филогенетических взаимосвязях двух видов рода Leymus : L. secalinus и L. litto-ralis, выявлена обособленность L. secalinus и ограниченность распространения вида северным побережьем оз. Байкал. Подтверждены данные Г. А. Пешковой, что вид является эндемиком побережий оз. Байкал. Ареал вида L. littoralis более обширен и охватывает Восточную Сибирь России, Внутреннюю Монголию Китая и Монголию.

Работа выполнена в рамках бюджетных проектов СО РАН № VI.52.1.7 (№ гос. регистрации 0337-2016-0001), РФФИ: № 11-04-00861, № 16-04-01605