Таксономическое разнообразие микробиома слепых отростков кишечника у цыплят-бройлеров и его изменение под влиянием комбикормов с подсолнечным шротом и сниженной обменной энергией

Использование в рационах сельскохозяйственной птицы продуктов переработки подсолнечника как самого дешевого источника белка расти-

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда по научному проекту «Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы» ¹ 14-16-00140.

тельного происхождения привлекает внимание многих специалистов. Однако при составлении рациона необходимо учитывать недостатки, присущие такому корму: по сравнению с соевым подсолнечный шрот не только имеет более низкую энергетическую ценность (139-209 Ккал на 100 г) и содержит на 1,5 % меньше необходимого птице лизина, но и включает существенно большее количество некрахмалистых полисахаридов, в основном представленных целлюлозой, гемицеллюлозой, пектиновыми веществами и лигнином (1, 2). Отметим, что птица не способна самостоятельно усваивать некрахмалистые полисахариды вследствие отсутствия необходимых ферментов (амилаз, целлюлаз и др.). Переваривание этих компонентов возможно только благодаря микробиальным ферментам, в связи с чем сложно переоценить роль микроорганизмов в пищеварении птицы: вместе с расщеплением нутриентов до доступных продуктов они дополнительно обеспечивают ее многими необходимыми веществами — соединениями с антибиотическими свойствами, белками, гормонами, витаминами и др. (3-6).

Микробиология пищеварения весьма сложна и малоизученна (7-9), чем, в частности, объясняется актуальность исследований микробиоценоза кишечника птицы на фоне рационов различной структуры. Большинство имеющихся сведений об этой микрофлоре получены с использованием классических микробиологических методов, согласно которым основу сообщества составляют бифидобактерии, стрептококки, лактобактерии, лак-татферментирующие бактерии, эубактерии, бактероиды и энтеробактерии (3, 10, 11). Однако уже очевидно, что значительная часть микроорганизмов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) — некультивируемые виды (12).

Уникальные возможности для изучения состава микробиома открывают современные молекулярно-генетические методы. Так, в кишечнике птицы обнаружено до 140 родов бактерий, из которых только 10 % идентифицированы по бактериальному гену 16S-рРНК, а остальные принадлежат к новым видам и, возможно, родам (13-15). Разрешающая способность и производительность ПЦР-анализа и NGS-секвенирования (next generation sequencing) дают достоверную информацию обо всех изменениях микробиома кишечника под действием определенных факторов (16). Несмотря на широкое использование указанных методов для изучения численности и таксономического разнообразия микроорганизмов в кишечнике человека (17, 18), в отношении птицы имеются лишь единичные сообщения. В частности, они касаются состояния микробиома ЖКТ при заражении птицы патогенными бактериями Campylobacter jejuni (19, 20), под влиянием кокцидиостатиков (21) и в связи с продуктивностью (22, 23).

В представляемом исследовании, использовав NGS-секвенирование и ПЦР в реальном времени, мы показали, что у бройлеров, вопреки традиционным взглядам, микробиом слепых отростков кишечника имеет богатую и разнообразную таксономическую структуру, включает как облигатных представителей ЖКТ, так и неидентифицированные таксоны, при этом энтерококки и бифидобактерии занимают в сообществе минорное положение, а типичные патогенные микроорганизмы полностью отсутствуют. Впервые с помощью этого подхода были детально охарактеризованы изменения в структуре микробиома слепых отростков у бройлеров под влиянием подсолнечного шрота, что сопровождалось снижением продуктивности.

Цель работы заключалась в изучении особенностей бактериального сообщества в слепых отростках у цыплят-бройлеров на фоне рационов с соевым и подсолнечным шротом.

Методика. Опыты проводили в виварии ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП» на 4 группах цыплят кросса Сobb 500 (по 35 особей, аналогичных 818

по живой массе). Птица получала полнорационные комбикорма с питательностью согласно рекомендациям Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ВНИТИП) (1). В 21-суточном возрасте в рацион цыплят вводили комбикорм (ВНИТИП) без включения подсолнечного шрота (контроль) и с включением 25 % подсолнечного шрота («ЭФКО», Россия) при снижении количества обменной энергии на 4,88 Ккал/100 г и сырого протеина на 1,01 %. Живую массу цыплят определяли на 21-е и 36-е сут индивидуальным взвешиванием, потребление корма — ежедневным учетом заданных кормов и их остатков по общепринятым методикам (24). Отбор материала содержимого слепых отростков ЖКТ для молекулярно-генетических исследований проводили у 6 цыплят (по 3 из каждой группы) при убое в 36-суточном возрасте со строгим соблюдением стерильности в соответствии с установленными требованиями (25).

Тотальную ДНК из образцов выделяли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя. Состав и структуру популяции бактерий определяли методом NGS-секвенирования: амплификацию проводили с помощью прибора Verity («Life Technologies, Inc.», США) и праймеров 343F/806R (5‘-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3' и 5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'), фланкирующих участок V3-V4 гена 16S-рРНК, секвенирование — на установке MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.», США) согласно рекомендациям производителя. Для обработки ридов 2½300 нт и определения таксономической принадлежности последовательностей ДНК до рода использовали биоинформатическую платформу CLC Bio GW 7.0 («Qiagen N.V.», Нидерланды). ПЦР в реальном времени для учета общей численности бактерий выполняли на амплифи-каторе ДТ Lite-4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), применив «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя EVA Green (ЗАО «Синтол», Россия) и праймеры Eub338/Eub518 (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' и 5'-ATTACCGCGG-CTGCTGG-3'), в следующем режиме: 3 мин при 95 °С; 40 циклов — 13 с при 95 °С, 13 с при 57,6 °С, 30 с при 72 °С.

Математическую и статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2010.

Результаты . В настоящем исследовании основное внимание было обращено на микробиом слепых отростков, так как известно, что именно в этом отделе содержимое кишечника задерживается на самое длительное время и происходят основные процессы микробиального протеолиза, расщепления целлюлозы и крахмала (26, 27). Полученные данные подтвердили неодинаковый эффект исследуемых рационов в отношении структуры микробиома.

При таксономическом анализе последовательностей ДНК их значительную долю (в контроле — 7,17±0,28 %, в опыте — 7,91±0,37 %) не удалось отнести ни к одному известному таксону (табл. 1). О подобном сообщалось и ранее (12-15), что указывает на полное отсутствие знаний о существовании таких таксонов, а потому и попыток их изучения. Идентифицированные бактерии по результатам анализа были отнесены к пяти филам. В слепых отростках ЖКТ доминировали представители филы Firmicutes из семейств Ruminococcaceae (19,81±0,97 %) и Clostridiaceae (23,06±1,19 %), обладающие амило- и целлюлозолитическими ферментами, а также филы Bacteroidetes (29,60±1,49 %) с амило- и протеолитической активностью. В наших исследованиях подтвердились данные ряда авторов, показавших с помощью NGS-секвенирования, что в слепых отростках кишечника бройлеров доминируют бактерии филы Firmicutes (19,

21), а также родов Clostridium и Bacteroides (23). В то же время полученные нами результаты противоречат другим сообщениям, в которых указывается на доминирование представителей филы Proteobacteria (22) . Вероятно, некоторые расхождения при анализе микрофлоры слепых отростков птицы методом NGS-секвенирования могут быть связаны как с различиями в изучаемом регионе гена 16S-рРНК и приборной базы, так и с другими факторами — климатическими условиями, санитарно-гигиенической обстановкой, рационом, применением антибиотиков, возрастом и кроссом птицы (19, 21).

1. Численность и соотношение бактериальных таксонов в слепых отростках кишечника у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 в возрасте 36 сут в зависимости от структуры рациона ( Х ± х , виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», 2015 год)

Показатель	I группа (кон-	II группа (опыт,
	троль, n = 3)	n = 3)
Общая численность бактерий, экв. геномов/г содержимого	3,4½109±1,6½108	5,0½1010±1,4½109
Встречаемость таксона, %:
фила Bacteroidetes	29,60±1,49	21,13±0,95*
род Bacteroides sp.	18,50±0,93	16,62±0,83*
род Alistipes sp.	10,62±0,52	4,39±0,20*
неклассифицированные Rikenellaceae	0,39±0,02	0,10±0,01*
фила Firmicutes	58,48±2,94	68,95±2,75*
неклассифицированные Firmicutes	6,55±0,34	5,84±0,04*
класс Clostridia	42,12±2,01	35,49±1,77*
неклассифицированные Clostridia	0,55±0,13	0,66±0,03
неклассифицированные Clostridiales	7,53±0,36	9,35±0,34*
семейство Clostridiaceae	23,06±1,19	19,43±0,87*
род Clostridium sp.	7,47±0,33	5,15±0,22*
род Butyricicoccus sp.	3,25±0,15	1,36±0,06*
род Flavonifractor sp.	0,90±0,04	0,22±0,01*
род Pseudoflavonifractor sp.	0,73±0,03	0,57±0,02*
род Oscillibacter sp.	0,60±0,03	0,10±0,00*
сем. Ruminococcaceae	19,81±0,97	17,14±0,84*
неклассифицированные Ruminococcaceae	13,05±0,64	11,13±0,50*
род Faecalibacterium sp.	5,98±0,29	5,14±0,22*
род Subdoligranulum sp.	0,40±0,02	0,36±0,02
род Ruminococcus sp.	0,29±0,02	0,17±0,01*
семейство Eubacteriaceae	0,14±0,02	0,16±0,01
семейство Lachnospiraceae	1,12±0,05	0,76±0,04*
род Lactobacillus sp.	8,80±0,43	26,79±0,65*
род Enterococcus sp.	0,10±0,00	0,01±0,00*
порядок Bacillales	0,29±0,01	0,45±0,02*
семейство Erysipelotrichaceae	0,47±0,02	0,19±0,01*
фила Actinobacteria	0,60±0,03	1,27±0,05*
род Bifidobacterium sp.	0,18±0,01	0,06±0,00*
семейство Coriobacteriaceae	0,42±0,02	0,51±0,02*
фила Proteobacteria	4,14±0,21	0,74±0,03*
род Escherichia sp.	2,77±0,12	0,05±0,00*
семейство Sutterellaceae	0,59±0,03	0,33±0,11*
род Bilophila sp.	0,30±0,01	0,06±0,01*
фила Tenericutes (род Anaeroplasma sp.)	0,01±0,00
неклассифицированные последовательности	7,17±0,28	7,91±0,37*

П р и м еч а ни е. I и II группа — соответственно основной рацион без включения подсолнечного шрота и с включением 25 % подсолнечного шрота при снижении количества обменной энергии на 4,88 Ккал/100 г и сырого протеина на 1,01 %. Прочерк означает, что микроорганизмы присутствовали в количестве ниже предела достоверного определения методом NGS-секвенирования.

^* Различия с контролем достоверны при p ≤ 0,05.

Другие бактерии с целлюлозо- и амилолитическими свойствами из семейств Lachnospiraceae (1,12±0,05 %) и Eubacteriaceae (0,14±0,01 %) присутствовали в меньшем количестве (см. табл. 1). Ранее считалось, что бактерии семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae обитают только в рубце жвачных (4). Кроме того, благодаря высокой чувствительности NGS-секвенирования были выявлены представители родов Alistipes и Fae-calibacterium (продуценты короткоцепочечных жирных кислот), которые ранее исследователям не удавалось обнаружить при использовании других молекулярно-генетических методов (28). Доля Escherichia sp. также была невелика (2,77±0,12 %), что не согласуется с традиционным мнением о них как типичных обитателях кишечника птицы (4).

Мы обнаружили высокую долю облигатных представителей ЖКТ птицы из рода Lactobacillus (8,80±0,43 %), которые способны к конкурентному вытеснению патогенов благодаря синтезу органических кислот и бактериоцинов (3). Стоит отметить, что некоторыми исследователями в слепых отростках также был выявлен значительный процент представителей рода Lactobacillus (23).

Другие бактерии с аналогичными свойствами из семейства Bifi-dobacteriaceae и рода Enterococcus sp. в сообществе были минорными (менее 1 %), что тоже не соответствует традиционным представлениям. Минорными были также бактерии фил Actinobacteria , Tenericutes , семейств Erysipelotrichaceae и Sutterellaceae . Интересно, что другие облигатные обитатели микрофлоры ЖКТ птицы — лактатферментирующие ( Selenomonas sp., Megasphaera sp.) и типичные патогенные виды ( Campylobacter sp., Staphylocoссus sp.), населяющие ЖКТ, в слепых отростках у исследованных цыплят полностью отсутствовали.

Добавление в рацион цыплят-бройлеров 25 % подсолнечного шрота привело к увеличению общей численности бактерий в 14,70 раза (см. табл. 1). Известно, что растворимые некрахмалистые полисахариды способны повышать вязкость химуса, а нерастворимые образуют полимерный матрикс, препятствующий равномерному перемешиванию пищеварительных масс, в результате чего снижается интенсивность пристеночного пищеварения (29). Поэтому, вероятно, именно менее интенсивное продвижение содержимого по пищеварительному тракту птицы способствовало скоплению бактерий и, соответственно, увеличению их общей численности.

В структуре микробиома слепых отростков у цыплят-бройлеров из II группы (см. табл. 1) достоверно уменьшалась доля представителей филы Bacteroidetes sp. (в 1,40 раза), а также семейства Clostridiaceae (в 1,20 раза), обладающих, как правило, ферментами для расщепления крахмалистых полисахаридов (амилазы и др.). Кроме того, снизился процент целлюлозоли-тиков — семейств Ruminococcaceae (в 1,16 раза) и Lachnospiraceae (в 1,48 раза). Таким образом, увеличение содержания некрахмалистых полисахаридов в рационе привело к уменьшению количества бактерий с амило- и целлюлозолитическими свойствами, что свидетельствует о снижении активности метаболизма легкогидролизуемых компонентов и клетчатки кормов.

Также выявлено расхождение между полученными результатами и традиционным утверждением о том, что высокое содержание некрахмалистых полисахаридов в кормах и, соответственно, замедление продвижения кишечного содержимого способствуют росту численности патогенной и другой нежелательной микрофлоры. Напротив, результаты наших исследований свидетельствуют об обратном эффекте: при введении в рацион 25 % подсолнечного шрота доля возбудителей инфекционных заболеваний семейства Sutterellaceae достоверно снижалась в 1,80 раза, семейства Ery-sipelotrichaceae — в 2,50 раза, доля представителей рода Escherichia sp., среди которых могут встречаться виды, способные вызывать дисбиотиче-ские нарушения макроорганизма, — в 55 раз (см. табл. 1). Кроме того, на фоне рациона с добавлением подсолнечного шрота обнаружилось увеличение доли облигатных представителей кишечной нормофлоры птицы — молочнокислых бактерий рода Lactobacillus (в 3,04 раза) и бацилл порядка Bacillales (в 1,50 раза), которые, как правило, благодаря синтезу органических кислот и бактериоцинов способны к антагонистическому вытеснению патогенных видов (3). В то же время отмечалось достоверное сниже- ние доли других бактерий с аналогичными свойствами, присутствующих в сообществе слепых отростков в минорных количествах, — родов Bifidobacterium sp. (в 3 раза) и Enterococcus sp. (в 10 раз).

С изменениями в структуре бактериального ценоза оказалась связана продуктивность исследуемых цыплят-бройлеров (табл. 2). Наиболее высокие показатели продуктивности отмечали в группе, где в рацион цыплят не добавляли подсолнечный шрот.

2. Динамика показателей продуктивности у цыплят-бройлеров кросса Cobb 500 в зависимости от структуры рациона ( Х ± х , виварий ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП», 2015 год)

Показатель	] I группа (контроль, n = 35)	II группа (опыт, n = 35)
Сохранность, %	100,0	97,1
Живая масса, г:
1-суточные	44,00±0,20	44,00±0,17
21-суточные	870,00±20,40	875,00±19,75
36-суточные	2142,00±45,40	2017,00±53,30*
в том числе
петушки	2380,00±34,42	2261,00±36,12*
курочки	1904,00±27,92	1773,00±34,17*
Среднесуточный прирост живой массы,	г:
с 1-х по 36-е сут	58,30±2,30	54,81±2,19*
за период опыта (22-36-е сут)	84,80±3,12	76,13±2,14*
Потреблено корма, кг:
всего	3,44±0,15	3,69±0,12
за период опыта (22-36-е сут)	2,25±0,10	2,28±0,08
Затраты корма, кг:
1-36-е сут	1,64±0,04	1,87±0,06*
22-36-е сут	1,77±0,07	2,00±0,10*

П р и м еч а ни е. I и II группа — соответственно основной рацион без включения подсолнечного шрота и с включением 25 % подсолнечного шрота при снижении количества обменной энергии на 4,88 Ккал/100 г и сырого протеина на 1,01 %.

^* Различия с контролем достоверны при p ≤ 0,05.

Итак, методами NGS-секвенирования и ПЦР-анализа впервые показано, что, вопреки традиционным взглядам, микробиоценоз слепых отростков кишечника цыплят-бройлеров характеризовался богатой и разнообразной таксономической структурой и включал как облигатных представителей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) птицы (семейства Clostridiaceae , Eubacteriaceae , Lactobacillaceae , фила Bacteroidetes ), так и ряд неидентифи-цированных таксонов. Классическим представлениям также противоречили полученные данные о том, что при этом энтерококки и бифидобактерии занимали в сообществе минорное положение, а типичные патогенные микроорганизмы ЖКТ птицы ( Camphylobacter sp., Staphylocoссus sp.) полностью отсутствовали. Введение в рацион цыплят 25 % подсолнечного шрота приводило к изменению численности и структуры микробиома слепых отростков кишечника и было связано с достоверным снижением продуктивных качеств птицы. Применение молекулярных методов (NGS-секвенирование и ПЦР в реальном времени) позволяет провести детальный анализ структуры микробной популяции, ее зависимости от режимов кормления и углубленно изучать микробиологию пищеварения, рассматривая ее как фактор устойчивости, жизнеспособности и продуктивности птицы.