Ветеринарная микробиология, микробиомы. Рубрика в журнале - Сельскохозяйственная биология
Разработка метода выявления Anaplasma marginale с использованием ПЦР в реальном времени
Статья научная
Риккетсия Anaplasma marginale - возбудитель анаплазмоза крупного рогатого скота. Заболевание протекает с признаками анемии, лихорадки и потерей веса, вызывает аборты и снижение удойности у коров и во многих случаях приводит к гибели зараженных животных. A. marginale переносится клещами и кровососущими насекомыми. Анаплазмоз обычно диагностируется при микроскопическом исследовании мазков крови, окрашенных по Романовскому красителем Гимза, но этот метод ненадежен, если животное находится на ранних стадиях инфицирования. Широко используются серологические методы диагностики, однако они не позволяют дифференцировать А. marginale от других видов анаплазм. Подход, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, сочетает высокую специфичность анализа и возможность количественной оценки числа копий ДНК патогена в образце. Цель выполненного нами исследования - разработать метод дифференцированного выявления A. marginale в крови крупного рогатого скота с помощью ПЦР в реальном времени. В качестве мишени для амплификации был выбран однокопийный ген msp4. Msp4 - иммунодоминантный белок наружной мембраны всех известных на сегодняшний день риккетсий рода Anaplasma. Праймеры на основе гена msp4 для филогенетического анализа А. marginale ранее были предложены J. de la Fuente с соавт. (2001), однако они не видоспецифичны. В результате анализа нуклеотидных последовательностей гена msp4 разных изолятов A. marginale и близкородственных видов анаплазм, включая A. ovis, выявили характерные для A. marginale участки, на основе которых были разработаны видоспецифичные праймеры и флуоресцентно меченный зонд (MSP4-F 5′-CA-TGAGTCACGAAGTGGCT-3′ и MSP4-R 5′-GGCACACT-CACATCAATC-3′, MSP4-probe 5′-(Cy5)-AAGGGGGAGTAATGGGAGGTAGCT-3′) для амплификации и детекции фрагмента гена msp4 A. marginale длиной 177 п.н. методом ПЦР в реальном времени. Анализ амплифицированных нуклеотидных последовательностей показал, что они имеют 99-100 % идентичности с фрагментом гена msp4 у разных изолятов A. marginale. При определении аналитической чувствительности ПЦР была сконструирована плазмида pGEM -msp4 с фрагментом гена msp4 длиной 177 п.н. и получены образцы, содержащие 10 0-10 7 копий msp4. Показано, что чувствительность метода позволяет выявлять от 10 2 копий гена msp4 А. marginale в анализируемом объеме образца ДНК. Для испытания аналитической специфичности праймеров и зонда использовались образцы ДНК овец, зараженных риккетсиями A. ovis, а также ДНК коров, которые по результатам секвенирования содержали ДНК бактерий Sanguibacter keddieii, Propionibacterium acnes и Pseudomonas aeruginosa. При этом роста флуоресценции, характерного для материала от зараженных A. marginale животных, и каких-либо продуктов ПЦР при электрофоретическом разделении не наблюдали. Таким образом, специфичность метода позволяет надежно дифференцировать A. marginale и A. ovis. Разработанный способ выявления A. marginale на основе амплификации и детекции фрагмента гена msp4 с помощью ПЦР в реальном времени отличается от существующих аналогов высокой специфичностью, быстротой, а также возможностью количественной оценки бактериальной нагрузки. Метод может быть использован для оперативного дифференциального обнаружения и количественного определения А. marginale в образцах крови инфицированного крупного рогатого скота с целью подтверждения диагноза и при проведении эпидемиологического мониторинга анаплазмоза.
Бесплатно
Статья научная
Мастит (воспаление молочной железы) - одно из широко распространенных инфекционных заболеваний молочного скота, наносящее существенный экономический ущерб животноводству и влияющее на качество молочной продукции. Показано, что маститы у коров чаще всего вызывают стафилококки, причем наиболее распространен золотистый стафилококк Staphylococcus aureus. Одним из индикаторов, указывающих на наличие субклинической формы маститов, служит повышение содержания в молоке соматических клеток (somatic cell, SC). Целью настоящей работы была оценка наличия гемолитических микроорганизмов - стрептококков и стафилококков во взаимосвязи с содержанием соматических клеток (somatic cell count, SCC) в молоке высокопродуктивных молочных коров и характеристика антибиотикорезистентности выделенных из молока штаммов Staphylococcus aureus. Для скрининга использовали пробы молока клинически здоровых коров голштинской породы, отобранные от всех животных в стаде, с 1-й по 7-ю лактации ( n = 345, Московская обл., 2015 год). В зависимости от наличия в молоке микроорганизмов исследуемая выборка коров была разделена на четыре группы: I - гемолитические стрептококки и S. aureus не обнаружены; II - обнаружены только гемолитические стрептококки; III - присутствуют только S. aureus ; IV - обнаружены гемолитические стрептококки и S. aureus. Профиль антибиотикочувствительности изолятов S. aureus определяли на специальной среде диско-диффузион-ным методом. Наличие метициллин-резистентных стафилококков (MRSA) определяли с помощью теста MRSA Alert w/swabs («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия). В качестве референтных штаммов использовали Staphylococcus aureus MRSA ATCC 43300 и Staphylococcus aureus ATCC 25923. Согласно полученным результатам, только у 22,0 % клинически здоровых коров в молоке не содержалось изучаемых форм микроорганизмов, в то время как у 78,0 % было установлено наличие гемолитических стрептококков и(или) S. aureus. Выявлена тенденция к повышению доли коров, содержащих S. aureus, с увеличением номера лактации - с 14,7-19,2 % у животных 1-2-й лактаций до 32,0-45,2 % у животных с 3-й и последующих лактаций. Были установлены достоверно более высокие значения SCC в молоке коров III группы: +1191,1 тыс.; +1124,3 тыс. и +1099,6 тыс. кл/см 3 (p 3, IV группы - от 1,0 до 7,8 lg КОЕ/см 3 и в среднем составило соответственно 3,62±0,36 и 3,47±0,23 lg КОЕ/см 3. Зависимости между титрами S. aureus в молоке коров и SCC не выявили. Более 95,0 % изолятов S. aureus были устойчивы к линкомицину, 59,5 % - к эритромицину, 50,6 % - к фузидину. Более 95,0 % изолятов S. aureus оказались чувствительны к оксациллину, гентамицину и ванкомицину. Некоторые штаммы были устойчивы к оксациллину (1,3 %), что требует дальнейшего изучения их генетической структуры с применением молекулярных методов.
Бесплатно
Статья научная
В настоящее время продукты переработки подсолнечника как самого дешевого источника белка растительного происхождения по сравнению с соевыми жмыхами и шротами рассматриваются в качестве альтернативы последним в рационе сельскохозяйственной птицы. Однако подсолнечный шрот имеет более низкую энергетическую ценность и содержит меньше необходимого птице лизина, в то же время включая существенно большее количество некрахмалистых полисахаридов, которые птица не способна усваивать самостоятельно из-за отсутствия необходимых ферментов (амилаз, целлюлаз и др.). Переваривание указанных компонентов рациона возможно только благодаря микробиальным ферментам. У птицы именно в слепых отростках содержимое кишечника задерживается на самое длительное время и происходят основные процессы микробиального протеолиза, расщепления целлюлозы и крахмала. Используя NGS-секвенирование и ПЦР в реальном времени, мы сравнили численность и состав бактериального сообщества в слепых отростках кишечника у цыплят-бройлеров кросса Сobb 500 в возрасте 36 сут, которые получали рационы на основе комбикормов, содержащих соевый и подсолнечный шроты. Вопреки традиционным взглядам, исследуемый микробиоценоз характеризовался богатой и разнообразной таксономической структурой и включал как облигатных представителей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) птицы (семейств Clostridiaceae, Eubacteriaceae, Lactobacillaceae, фила Bacteroidetes ), так и ряд неидентифицированных таксонов. Классическим представлениям также противоречили полученные данные о том, что при этом энтерококки и бифидобактерии занимали в сообществе минорное положение, а типичные патогенные микроорганизмы ЖКТ птицы ( Camphylobacter sp., Staphylocoссus sp.) полностью отсутствовали. В представляемом исследовании были впервые детально охарактеризованы изменения в составе микробиома слепых отростков в зависимости от используемых комбикормов. Установлено, что включение в рецептуру комбикорма 25 % подсолнечного шрота приводило к увеличению общей бактериальной численности в 14,70 раза, а также к снижению доли амилолитических бактерий семейств из филы Bacteroidetes в 1,40 раза и семейства Clostridiaceae - в 1,20 раза, целлюлозолитических бактерий семейств Ruminococcaceae - в 1,16 раза, Lachnospiraceae - в 1,48 раза, что свидетельствует об уменьшении метаболизма легкогидролизуемых компонентов и клетчатки корма. Также изменялось содержание облигатных представителей кишечной нормофлоры птицы: доля бактерий рода Lactobacillus sp. увеличивалась в 3,04 раза, порядка Bacillales - в 1,50 раза, тогда как родов Bifidobacterium sp. и Enterococcus sp. - уменьшалась соответственно в 3 и 10 раз. В отличие от классических представлений, свидетельствующих о росте содержания нежелательной микрофлоры в ЖКТ при высоком количестве некрахмалистых полисахаридов в рационах птицы, в слепых отростках бройлеров, получающих в составе комбикорма 25 % подсолнечного шрота, отмечалось достоверное снижение доли бактерий рода Escherichia sp. (в 55 раз), а также семейств Erysipelotrichaceae (в 2,50 раза) и Sutterellaceae (в 1,80 раз), включающих ряд видов, способных вызывать дисбиотические нарушения в макроорганизме. Кроме того, было установлено, что с перестройкой бактериального сообщества сопряжено изменение показателей продуктивности птицы. Живая масса как у петушков, так и у курочек оказалась максимальной (2142,0±45,40 г) в 36-суточном возрасте в контрольной группе, не получавшей подсолнечной шрот, по сравнению с показателем в опытной группе (2017,0±53,30 г). Наряду с этим затраты корма на выращивание птицы в опытной группе возросли на 13 %.
Бесплатно
