Технологии иммуногенетических исследований для оценки воздействия внешнесредовых факторов на здоровье населения

В условиях антропогенно измененной экологической ситуации и хронического воздействия техногенных факторов на человека возникают адаптационные нарушения, ассоциированные прежде всего с иммунной системой, которые при соответствующей генетической детерминации уже в детском возрасте реали-

(С Долгих О. FL Кривнов A В., Старкова К Г, Бубнова О. А, Отавина Е. А, .Аликина И. Н, БефученкоН. В., Гусельников М. А., 2016

з>ются в ранние доноюлогические нарушения состояния здоровья [Krzystyiiiak el al., 1995; Fromigue, Hay. Barbara, 2009; Hurtel-Lemaire et al., 2009; Los et aL 2009; Cavcrzasio. Thouvcrcy. 2011; Yang ct al., 2011: Yurchenko. Shlapatska. Sidorenko. 2012; Венгеровский, Хлусов, Нечаев, 2014].

Для решения задач ранней диагностики и повышения эффективности профилактики развития процессов дезадаптации в условиях техногенной экспозиции актуальным является использование наукоемких современных биомедицинских технологий ДЛЯ идентификации генетических И иммунологических нарушений здоровья населения [Dolgikh et al.. 2011; Зайцева. Устинова, Аминова. 2011: Долгих. Кривцов. Харахорина. 2012: Долгих и др., 2014: Зайцева и др., 2014].

Целью настоящих исследований являлась разработка технологий, принципов и методических подходов идентификации генетических маркеров ранних нарушений иммунного статуса населения в условиях хронической экспозиции техногенными факторами.

Материалы и методы исследования

ДНК-детекция включала исследования полиморфных вариантов изучаемых генов с использованием методики ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию и детекцию осуществляли с помощью термоциклера CFX96, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе. Обработку полуденных результатов проводили с помощью аллельной дискриминации. Данная методология позволяет различать гомозиготную замену’ от гетерозиготы и нормальной гомозиготы.

Проведена диагностика SNP на уровне ДНК регуляторных и экзонных областей 37 генов, в том числе, ген цитохрома Р450 (CYP1A1), ген метилентетрагидрофо л атредуктазы (MTHFR), ген аполипопротеина Е (АРОЕ), ген копропорфириноген оксидазы (СРОХ), ген васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF), ген эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), ген матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9), цитокиновый рецептор, запускающий апоптоз (FAS), транскрипционный фактор РЗ (FOXP3), ген фактора некроза опухоли альфа (TNFa). главный комплекс гистосовместимости (HLA-DRA), ген супрессор опухолевого роста Р53 (ТР53), гены рака груди 1 и 2 (BRCA1, BRCA2) и др.

При выполнении генетического диагностического обследования проведено секвенирование ДНК 6 детей в возрасте от 7 до 9 лет, постоянно проживающих в эндемичной зоне, характеризующейся повышенным содержанием стронция и нитратов в питьевой воде. Метод секвенирования позволил одновременно генотипировать ДНК по всем изучаемым генам. Библиотека зондов была подготовлена заранее по 27 интересующим нас генам и включала в себе около 2 млн олигонуклео-тидных зондов, комплементарных интересующим нас областям. Исследование включало расшиф-ровку значимых полиморфизмов экзонов и регуляторных областей.

Проведено изучение полиморфизма гена цитохрома Р450 (CYP1A2), генов интерлейкина (IL17F. IL17D, IL17C, IL17B), толл-подобного гомологичного гена (TLR4), обратной транскриптазы теломеразы (TERT). FAS. FOXP3. ТР53. главного комплекса гистосовместимости (HLA-DRB1). MTHFR. глутатиона s-трансферазы альфа (GSTA). гена сульфотрансферазы (SULT1A1). глюкокортикоидного рецептора (NR3C1). VEGF. цинк - металло-пептидазы (ZMPSTE). гена рецептора эстрогенов (ESR1). гена рецептора дофамина (ANKK1).

Технология выполнения секвенирования включала в себя несколько этапов: выделение ДНК человека из биологического материала (кровь), создание библиотеки ДНК; этапы амплификации библиотеки ДНК и гибридизованной ДНК; проведение эмульсионной ПЦР; постановка секвенирования на Приборе GS Junior (Швейцария).

Дизайн исследований включал в себя анализ следующих сочетаний предметов и объектов воздействия техногенных факторов; а) контингент риска, характеризующийся наличием экспозиции стронцием и нитратами, сопоставляемый с контингентом сравнения, проживающим Б условиях минимальной экологической нагрузки; б) различные Стратификационные уровни выборки - индивидуальный, популяционный, система «родители-дети»; в) биологические уровни анализа - клеточный уровень, молекулярный уровень.

Результаты и их обсуждение

Предложены методические подходы к проведению генетического тестирования вероятности развития иммунопатологии, заключающиеся в идентификации следующих групп полиморфизмов: вариантных генов ферментов 1- и 2-й фазы детоксикации (CYPIAL GSTA); генов белков, участвующих в патогенезе техногенных нарушений в органах-мишенях (ММР9, VEGF) и обменных процессах: генотипирование предрасположенности к онкопрол иферативным состояниям: определение им-муногенетических маркеров. Максимальное число полиморфно измененных участков генов выявлено в группе генов детоксикации, причем наибольший полиморфизм свойственен SULTIA1 и MTHFR. а наиболее консервативными из этой функциональной системы оказались SOD и СРОХ. Менее полиморфно изменены гены систем иммунной и нервной регуляции. При этом наибольшему полиморфизму из этой системы подвержен HLA-DRBI, что объяснимо с позиций регуляции иммунного ответа, многие же гены иммунного ответа и онкогенеза достаточно консервативны (табл. 1)*

В структуре мутаций максимальной полиморф-ностью обладали гены детоксикации - 37,5% из всей выборки генов, второй ранг занимали гены обмена 27,5%, замены в генах иммунорегуляции и соматических генах выражены в меньшей степени. Анализ общего количества точечных замен позволил определить среднее количество мутаций на одного человека по 25 кандидатным генам, которое составило 210 замен.

Таблица 1

Пример оформления таблицы и заголовка к ней для того же объекта K2SO4

Ген	Количество полиморфизмов в сравнении с референсной последовательностью
	1 и	2 п	3 и	4 п	5 и	6 п
MTHFR	13	13	13	14	23	23
CLCN6	0	1	0	0	1	1
ZMPSTE24	4	3	3	4	1	4
СРОХ	1	8	7	8	8	10
TERT	9	5	14	3	6	5
1L17B	0	2	0	2	1	1
PPARD	4	6	4	5	5	1
VEGFa	2	4	3	2	8	5
IL17F	0	0	0	0	0	1
GSTA4	И	12	9	15	И	15
SOD	4	0	6	2	0	6
HLA-DRB1	45	19	6	0	15	10
NOS3	19	14	12	14	12	14
TLR4	0	1	1	1	2	2
ACTA2	1	1	1	2	0	0
FAS	0	4	8	5	7	9
SIRT3	9	12	8	12	8	1
SULT1AI	41	33	37	К)	39	37

Примечание, CLCN6 -ген хлорилный канат б, АСТА2 - ген актинин альфа2,

Методология секвенирования позволила количественно оценить генетическое закрепление точечных замен в системе «мать-ребенок» , В случае постоянной экспозиции мутагеном не наблюдалась элиминация о дно нуклеотидных замен у потомства, либо выявлялось увеличение количества вариантных участков следующих генов: ген транскрипционного фактора РЗ, ген супрессор опухолевого роста, ген белка главного комплекса гистосовместимости, ген эндотелиального фактора роста, ген интерлейкина 17С (IL17C), ген сульфтрансферазы, ген теломеразы, ген белка сиртуина (SIRT), ген пролифератора пероксисом (PPARD), ген метилен-тетрагидрофолатредужтазы

Тогда как условия, соотносимые с референтным уровнем мутагена в среде, характеризовались фиксацией у потомства материнских генетических вариаций только по генам IL17C, белка сирту ина и метилентетрагидрофолатредуктазы а также цито-кинового рецепторак запускающего апоптоз - FAS. Причем общее число нуклеотидных замен по анализируемым генам у неэкспонированного ребенка было в 2 раза ниже экспонированного мутагеном.

Установлены негативные ассоциации полиморфизма генов детоксикации (CYP1AL СРОХ) характеризующиеся повышенной в 2 раза над группой контроля распространенностью гетерозиготного варианта гена CYP1A1, а также минорного гомозиготного варианта гена СРОХ, при отсутствии патологического аллельного варианта С С в группе контроля (табл, 2).

Таблица 2

Особенности генетического полиморфизма у детей, экспонированных стронцием и нитратами (встречаемость генотипов,%)

Ген	Генотип	Группа наблюдения	Группа сравнения
VEGF	GG	49	62
	GC	42	32
	GG	9	6
CYP1A1	GG	87	94
	GA	13	6
	АА	0	0
СРОХ	АА	74	69
	СА	23	31
	сс	3	0

Для полиморфизма генов пролиферации эндотелия характерно преобладание как минорной гомозиготы (в 1.5 раза), так и гетерозиготного генотипа (в 1,3 раза) по сравнению с теми же показателями в группе контроля. Выявленные изменения иммунных показателей у обследованных детей развиваются на фоне негативной генетической вариабельности. связанной с приоритетными генами иммунной регуляции и детоксикации.

Заключение

Использование современных биомедицинских технологий для типирования вариантных генов позволяет установить кандидатные полиморфизмы, реализующиеся в конкретных экологических условиях.