Технология экстракта сухого сбора мочегонного и изучение его фармакологической активности

Заболевания мочевой системы относятся к наиболее распространенным в медицинской практике. С учетом современных тенденций создания лекарственных препаратов и оздоровительных средств из растительного сырья, разработка суммарных лекарственных средств, имеющих комплексное воздействие на организм, является актуальной задачей. Создание оптимальной лекарственной формы позволяет в каждом конкретном случае обеспечить максимальную биологическую доступность и эффективность.

Мочегонный сбор, разработанный на кафедре фармакогнозии и ботаники ИГМУ, включает листья брусники обыкновенной, траву хвоща полевого, золотарника даурского, спорыша и столбики с рыльцами кукурузы в определенных соотношениях. Данная фитокомпозиция обладает антимикробной, противовоспалительной активностью и мочегонным действием, что обусловлено содержанием в ней флавоноидов, полифенольных соединений и фенологликозидов [1, 4]. Сухие экстракты являются перспективной технологической формой. Преимуществом сухих экстрактов (в том числе над жидкими и густыми) являются удобство дозирования и значительный срок хранения, составляющий от 2 до 5 лет.

Цель исследования

Разработать оптимальные условия получения экстракта сухого сбора мочегонного, провести его стандартизацию и определить фармакологическую активность.

Материалы и методы исследования

На I этапе исследования оптимальная ресурсосберегающая технология экстракта сухого сбора мочегонного (СМ) разрабатывалась по классической схеме с учетом индивидуальных особенностей компонентов сбора [1, 5].

Предварительно проведен товароведческий анализ 5 партий СМ, приготовленных в лабораторных условиях.

Товароведческие показатели сырья и сбора оценивали по общепринятым методикам для фармакопейного сырья по ГФ XI издания, а не фармакопейного сырья травы золотарника даурского в соответствии с проектом технических условий, разработанных на кафедре фармакогнозии и ботаники ИГМУ. Все виды сырья соответствовали требованиям нормативной документации [1, 4].

Оптимальные технологические показатели устанавливали по сумме выхода экстрактивных и биологически активных веществ.

Для подбора экстрагента сырьё экстрагировали спиртом этиловым в концентрациях от 20 до 90%.

Существенное влияние на эффективность процесса экстракции лекарственного растительного материала влияет степень измельченности, а также соотношение сырья и экстрагента. С этой целью сырье измельчали до размеров частиц на фракции: 0,5-1,0 мм; 2,03,0 мм; 4,0-5,0 мм, заливали спиртом этиловым 50%-ным в соотношении 1:14 (табл. 1, 2).

Существенную роль на процесс выхода веществ из сырья оказывает и кратность экстракции. Методика: навеску из 5 г сырья помещали в экстрактор, заливали 50%-ным спиртом 1:14, экстрагировали при помешивании с помощью магнитной мешалки при температуре 60 ° С (оптимальная температура выбрана на основании экспериментальных исследований). Экстрагирование проводили в три ступени. Через определенные промежутки времени каждого контакта фаз извлечения сливали, сушили и анализировали (табл. 3).

Оставшиеся профильтрованные извлечения объединяли и подвергали сушке в термостате при температуре 40-50 С до получения сухой массы. После снятия сухого экстракта проводили измельчение и оценку его качества.

На основании исследований составлена технологическая схема получения экстракта сухого СМ и проведена его стандартизация по содержанию влажности, флавоноидов в пересчете на кверцетин и суммы полифенольных соединений [4]. Результаты отражены в таблице 4.

На II этапе исследований проводилось изучение мочегонного и противовоспалительного действия и антиоксидантной активности.

Изучение мочегонного действия проводили на 30 белых мышах массой 20 г по методу Е.Б. Берхина [2]. Для исследования мочегонного действия использовали три группы животных по 10 мышей в каждой группе: опытной, сравнения и контрольной. При изучении водного диуреза животных содержали на постоянном пищевом рационе при свободном доступе к воде. До водной нагрузки животных выдерживали в течение двух часов без пищи и воды. Затем мышам вводили в желудок с помощью зонда изучаемый экстракт СМ (из расчета 0,1 г/кг веса животных) в объеме 1 мл одновременно с водной нагрузкой в количестве 0,3 мл на 10 г массы тела животного. Мочу собирали через каждый час в течение 4 часов. Препаратом сравнения явился отвар брусники листьев (1:10) в объеме 1 мл.

Аналогично контрольной группе мышей вводили эквиобъемное количество воды очищенной.

Эксперименты по установлению противовоспалительного действия экстракта сухого СМ проводили на 60 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 г. Изучали противовоспалительное действие экстракта сухого сбора мочегонного и препарата сравнения отвара брусники листьев (1:10) в объеме 2 мл энтерально. Исследования противовоспалительной активности сводились к оценке их влияния на экссудативную фазу воспаления по Ю.Е. Стрельникову [10], на фазу пролиферации по Ф.П. Тринусу [7] и на процесс альтерации по И.А. Ойвину [8].

Активность перекисного (свободнорадикального) окисления липидов (ПОЛ) изучали на 30 белых крысах Wistar, у которых вызывали тетрациклиновый гепатит [9]. Экстракт сухой СМ и отвар препарата сравнения ромашки аптечной цветков (1:10) вводили животным внутрижелудочно в объеме 2 мл. Контрольная группа крыс получала дистиллированную воду внутрижелудочно в эквиобъемном количестве. Содержание малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови определяли по методике Р.А. Темирбулатова и Е.И. Селезнева [11]. Кроме того, изучали в сыворотке крови крыс уровень содержания диеновых конъюгатов (ДК) [3].

Результаты эксперимента статистически обрабатывали при доверительной вероятности 95% [6].

Результаты и их обсуждение

Товароведческие показатели компонентов сбора удовлетворяют требованиям нормативной документации. При анализе сбора мочегонного установлено, что влажность в егоисследуемых партиях составила от 5,2 до 5,8%. Предложена норма по этому показателю не более 13%. Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых 50%-ным спиртом этиловым, от 35,06 до 37,25%. Норма по этому показателю не менее 35%. Содержание золы общей составило от 5,4 до 6,8%. Норма по этому показателю не более 7%. Содержание органических примесей составило от 0,31 до 0,41%, норма не более 0,5%. Минеральная примесь в исследуемых образцах содержится в незначительных количествах от 0,11% до 0,25%, норма – не более 0,5%.

Результаты исследований по разработке технологических показателей и результаты стандартизации экстракта сухого СМ представлены в таблицах 1-5.

Таблица 1

Технологические показатели сбора мочегонного (средние показатели)

Насыпная масса	0,2083
Коэффициент наполнения сбора	4,2
Коэффициент вытеснения сбора	0,6
Коэффициент наполнения набухшего сырья	0,02

Выход суммы экстрактивных веществ в зависимости от размера частиц сырья, г

Таблица 2

Диаметр частиц сырья, мм	Листья брусники	Столбики с рыльцами кукурузы	Трава золотарника даурского	Трава спорыша	Трава хвоща полевого
0,5 - 1	0,2545	0,2686	0.3345	0,2341	0,2576
2 - 3	0,2834 0	0,2739	0,3929	0,2566	0,2677
4 - 5	0,2198	0.2676	0,2987	0,2656	0,2512

Результаты позволили выбрать в качестве оптимального экстрагента спирт этиловый 50%-ный, степень мелкости для листьев брусники, травы золотарника даурского, столбиков с рыльцами кукурузы, хвоща полевого составила 2–3 мм, а для травы горца птичьего 4–5 мм при соотношении сырье-экстрагент 1:14, что обеспечивает максимальный выход экстрактивных и биологически активных веществ.

Таблица 3

Соотношение сырье – экстрагент (спирт этиловый 70%)	Масса сухого остатка в 10 мл извлечения, г	Теоретически рассчитанная масса экстракта, г	Выход экстракта к сырью, %
1:10	Плохая смачиваемость
1:12	0,09355	0,88725	18,48
1:14	0,16430	0,9858	19,71
1:16	0,15307	0,98722	19,38
1:18	0,13241	0,99862	19,69

* спирт этиловый 50%

Таблица 4

к о С и	Время экстракции, ч	Масса сухого остатка в 10 мл извлечения, г	Теоретически рассчитанная масса экстракта, г	Выход экстракта к сырью, %	Эффективность экстракции, %
1	0,5	0,15225	0,76125	15,22	42,70
	1,0	0,15270	0,88566	17,71	50,08
	1,5	0,16430	0,98580	19,71	55,38
	2,0	0,19050	0,95250	19,05	53,43
2	0,5	0,07430	0,37150	7,43	20,83
	1,0	0,07675	0,39725	7,94	22,32
	1,5	0,07320	0,36600	7,32	20,53
3	0,5	0,03005	0,17429	3,48	9,85
	1,0	0,03080	0,15400	3,08	8,63

Оптимальное соотношение сырья и экстрагента*

Влияние кратности экстрагирования на выход экстрактивных веществ и эффективность экстракции

Из таблицы 3 следует, что равновесное состояние при I контакте фаз достигается за 90 мин, при II за 60 и III за 30 мин. При этом трехкратная экстракция обеспечивала достаточно полное истощение сырья. Эффективность процесса экстракции на I ступени составила в пределах 55% , на II свыше 22 и на III около 9 %.

Таким образом, получен сухой экстракт на основе мочегонного сбора с эффективностью экстракции 85,35%.

Таблица 5

Стандартизации экстракта сухого сбора мочегонного

Образцы экстракта	Влажность,%	Количественное содержание X±∆X,%
		флавоноидов в пересчете на кверцетин, %	сумма фенологликоздов в пересчете на арбутин-стандарт, %	полифенольные соединения, %
1	4,97	2,18 ±0,06	2,21 ±0,09	22,26 ±0,03
2	4,86	2,15 ±0,06	2,26 ±0,09	22,13 ±0,03
3	5,00	2,55 ±0,06	2,31 ±0,09	23,07 ±0,03
4	4,93	2,16±0,04	2,22±0,08	23,02±0,02
5	4,91	2,44±0,05	2,30±0,08	22,84±0,02

Влажность в исследуемых образцах экстракта не превышала 5%. Содержание флавоноидов варьировалось от 2,15 до 2,55 %, фенологликозидов в пересчете на арбутин-стандарт в пределах 2,21-2,31%, а полифенольных соединений от 22,13 до 23,07%.

Результаты фармакологических исследований представлены в таблицах 6-10.

Экстракт сухой сбора мочегонного увеличивает мочевыделение в 1,5 раза (на 50%) по сравнению с контролем. Тогда как препарат сравнения повышает диурез животных на 43%.

Таблица 6

Диуретическая активность экстракта сухого сбора мочегонного (M±m), n=10

Условие	Контроль (вода очищенная)	Отвар брусники листьев	Экстракт сухой сбора мочегонного
Количество мочи, мл	1,6±0,1	2,3±0,02	2,5±0,05

Установлено, что экстракт сухой СМ оказывает антиэкссудативное действие, не уступающее препарату сравнения (табл. 7). Так, экстракт сухой сбора мочегонного снижал степень отека лапок крыс на 17%, тогда как настой ромашки аптечной цветков на 21% по сравнению с контролем.

Таблица 7

Влияние экстракта сухого сбора мочегонного на экссудацию при «формалиновом» отеке лапок у крыс (M±m), n=10

Условия опыта	Контроль (вода очищенная)	Настой ромашки аптечной цветков	Экстракт сухой сбора мочегонного
Объем вытесненной воды, мл	0,78±0,4	0,62±0,3	0,65±0,6

В следующей серии экспериментов на фоне введения животным экстракта сухого сбора мочегонного наблюдали отграничение очага асептического воспаления и стимуляцию образования грануляционной ткани на 7-е сутки. Масса сухой гранулемы, сформировавшейся вокруг стерильного шарика при введении данного исследуемого средства на 35% больше, чем в контрольной группе животных (табл. 8).

Таблица 8

Пролиферативное действие экстракта сухого сбора мочегонного (M±m), n=10

Условия опыта	Контроль (вода очищенная)	Настой ромашки аптечной цветков	Экстракт сухой сбора мочегонного
Вес влажных ватных шариков, мг	129±10	86±2	102±22
Вес сухих ватных шариков, мг	20±0,9	25±0,5	27±0,3

В результате третьей серии опытов установлено, что экстракт сухой сбора мочегонного уменьшает степень повреждения ткани. В частности, на 9-е сутки у крыс, получавших исследуемый препарат, площадь некротизированной ткани была на 8% меньше, чем у крыс контрольной группы, а у животных, получавших настой ромашки аптечной цветков, на 17%. Экстракт сухой СМ стимулирует регенераторные процессы, следствием чего являлось уменьшение площади альтерации на 29-е сутки опыта на 37%, тогда как у крыс, получавших настой ромашки аптечной цветков, площадь повреждения уменьшалась в 1,5 раза (табл. 9).

Таблица 9

Влияние экстракта сухой сбора мочегонного на площадь некротизированной ткани у белых крыс (M±m), n=10

Условия опыта	Контроль (вода очищенная)	Настой ромашки аптечной цветков	Экстракт сухой сбора мочегонного
9-е сутки
Площадь некротизиро- 2 ванной ткани, см	79±4	66±3	73±5
29-е сутки
Площадь некротизиро- 2 ванной ткани, см	76±3	34±1	48±2

На 7-е сутки эксперимента препарат сравнения настой ромашки аптечной цветков снижал уровень МДА на 23%, ДК на 49% по сравнению с контролем. Исследуемый препарат экстракт сухой СМ уменьшал показатели МДА и ДК на 17 и 34% соответственно.

Результаты изучения уровня андиокисдантной активности представлены в таблице 10.

Таблица 10

Влияние экстракта сухого сбора мочегонного на уровень малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в сыворотке крови у крыс (M±m), n=10

Показатели	Интактные животные	Контроль (вода очищенная)	Настой ромашки аптечной цветков	Экстракт сухой сбора мочегонного
МДА, мкмоль/мл мин	0,94 0,05	1,49 0,06	1,15 0,04	1,24 0,10
ДК, условные ед.	3,09 0,27	7,45 0,62	3,81 0,46	4,95 0,28

Обсуждение результатов

В результате исследований проведен товароведческий анализ фитокомпонентов и сбора мочегонного. Подобраны оптимальные условия получения экстракта сухого сбора мочегонного:  технологические показатели, тип экстрагента, оптимальная степень измельчения каждого компонента, соотношение сырье-экстрагент, кратность и время экстракции. Разработана технологическая схема производства экстракта сухого сбора мочегонного и проведена его стандартизация.

Показано, что сухой экстракт сбора мочегонного способствует повышению выделения количества мочи у опытной группы животных по сравнению с контрольной.

Изучаемое лекарственное средство ингибирует процессы перекисного окисления липидов, что было показано в экспериментах. Так, сухой экстракт сбора мочегонного способствует снижению накопления малонового диальдегида и диеновых конъюгатов.

Выводы

• 1.    Проведен товароведческий анализ фитокомпонентов экстракта сухого и сбора мочегонного.

• 2.    Разработана оптимальная технологическая схема производства экстракта сухого сбора мочегонного.

• 3.    Экстракт сухого сбора мочегонного обладает выраженным диуретическим и противовоспалительным действиями.

• 4.    Изучаемый экстракт сухой СМ оказывает умеренный антиоксидантный эффект.

• 5.    Экстракт сухого сбора мочегонного можно отнести к перспективным для внедрения в медицинскую практику в качестве растительного лекарственного средства.