Технология ускоренной оценки устойчивости селекционного материала подсолнечника к возбудителю ржавчины Puccinia helianthi Schwein

Научная статья УДК 633.854.78

Введение. В селекции сортов и гибридов подсолнечника одним из необходимых условий является отбор на устойчивость к основным патогенам, в частности – облигатным паразитам. Один из них – возбудитель ржавчины, базидиальный гриб Puccinia helianthi Schwein., который поражает подсолнечник во всех странах мира, где возделывается культура [1; 2]. Вредоносность болезни зависит от погодных условий и может привести к снижению урожая и качества семян, а в некоторых случаях к гибели растений [2].

Для создания устойчивого к возбудителю ржавчины селекционного материала подсолнечника в 80-е годы прошлого века во ВНИИМК был разработан метод, основанный на выращивании растений подсолнечника для искусственной инокуляции в условиях теплицы в сосудах с почвой до фазы 2– 4 пары настоящих листьев. В качестве инокулята для заражения листьев в то время использовали полевые изоляты P. helianthi Schwein. Идентифицированные по реакции трёх существовавших в то время дифференциаторов устойчивости подсолнечника изо-ляты были отнесены к расе 1 [3]. Результаты идентификации подтверждены Сэкстоном [4]. Оптимальная инфекционная нагрузка составляла 100–110 тысяч спор в 1 мл водной суспензии и подсчитывалась с помощью камеры Горяева. Заражённые растения помещали во влажную камеру, накрывая полиамидной плёнкой, и выдерживали сутки в темноте при температуре 20–21 °С. После чего их выращивали в условиях 16-часового фотопериода и температуры 25–26 °С в течение 9–10 дней до появления на листьях уре-диний [5]. На трудоёмкий процесс оценки ограниченного количества образцов селек- ционного материала уходило около месяца. С помощью этого метода были получены сорта подсолнечника, устойчивые к распространённому в то время биотипу возбудителя, названному расой 1. Возделывание полученных сортов на долгое время устранило проблему заболевания подсолнечника ржавчиной в РФ [6].

Однако способность облигатных паразитов эволюционировать и формировать новые патотипы, преодолевающие устойчивость гибридов и сортов возделываемого сортимента подсолнечника, обусловливает необходимость непрерывности отбора на иммунитет [7]. Успех селекции устойчивых к возбудителю ржавчины генотипов подсолнечника в значительной степени зависит от применяемых методов выращивания и заражения растений в контролируемых условиях внешней среды, оптимальных для патосистемы хозяин-паразит.

С распространением на посевах подсолнечника в регионах Российской Федерации новых биотипов возбудителя ржавчины возникла необходимость разработки технологии ускоренной оценки устойчивости селекционного материала.

Нами обнаружено, что споры из отдельных урединий возбудителя ржавчины, собранные даже с одного листа поражённого растения подсолнечника, различаются по вирулентности [8]. В таком случае суспензия возбудителя для инокуляции растений подсолнечника состоит из смеси разных биотипов, и, следовательно, далеко не всегда обеспечивается оптимальная концентрация нужного для заражения биотипа [9]. Поэтому для фенотипической оценки устойчивости растений предложено использовать клонирование отдельных спор с идентифицированным кодом вирулентности. Для экспериментов был выбран биотип с кодовым номером 700, преобладающий в настоящее время в выборках изолятов гриба из разных регионов РФ [10].

Цель исследования – разработать технологию ускоренной оценки устойчивости генотипов подсолнечника к новым биотипам возбудителя ржавчины с применением выделения и размножения урединиоспор нужной вирулентности клонального происхождения, заражения ими семядольных листьев проростков подсолнечника в лабораторных условиях без использования почвенного субстрата.

Для достижения цели разработали: метод получения и быстрого размножения клонов спор из отдельных урединий; способ заражения и оптимальную инфекционную нагрузку для семядольных листьев пятидневных проростков подсолнечника; лабораторный метод их выращивания в оптимальных условиях освещения и температуры; шкалу для оценки степени поражения семядольных листьев разных генотипов растения-хозяина.

Материалы и методы. Разработка новой технологии ускоренной оценки устойчивости селекционного материала подсолнечника к возбудителю ржавчины является продолжением исследований авторов, выполненных в лаборатории иммунитета ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в период 2018– 2024 гг.

Для получения инокулюма листья со спо-роношением возбудителя ржавчины собирали с поражённых ржавчиной растений подсолнечника в 14 регионах РФ. Уреди-ниоспоры (полевой изолят) стряхивали с листьев на пергамент и помещали в криопробирки, на этикетках которых подписывали место сбора и дату, хранили при температуре -18... -20 °С.

Семена линий-дифференциаторов устойчивости подсолнечника к ржавчине (СМ 90, СМ 29, Р-386, HAR-1, HAR-2, HAR-3, HAR-4, HAR-5) и сорта ВНИИМК 8883 улучшенный, восприимчивого ко всем расам патогена, высевали рядами в цветочные ящики вместимостью 6 кг почвы и помещали в камеру искусственного климата, где растения выращивали при температуре 25 °С днём и 23 °С ночью 16-часовом фотопериоде до появления второй пары настоящих листьев. Полив растений осуществляли ежедневно.

Для заражения использовали как споры полевых изолятов, так и выделенные клоны спор из отдельных урединий.

Схемой опыта по определению оптимальной инфекционной нагрузки для заражения 100–110 пятидневных проростков подсолнечника восприимчивого сорта было предусмотрено пять вариантов: 1; 2; 3; 4; 5 мг урединиоспор на 10 мл воды.

При сравнении оценки устойчивости образцов по разрабатываемой технологии и обычным способом выращивания и заражения использовали по 10 учётных растений 20 генотипов подсолнечника коллекции ВНИИМК. Учитывали количество пораженных растений в % и степень поражения по количеству урединий на листе. Тип реакции определяли по разработанной нами шкале [8] (табл. 1).

Таблица 1

Шкала иммунологической реакции растений подсолнечника на заражение возбудителем ржавчины P. helianthi Schwein.

Table 1

Scale of the immunological response of sunflower plants to infection with the rust pathogen P. helianthi Schwein.

Балл	Тип реакции растений	Степень поражения растений после заражения возбудителем ржавчины P. helianthi
0	VR Иммунный, высокоустойчивый	Отсутствие видимой реакции на заражение
1	R Устойчивый	Пустулы отсутствуют, мелкие светлые точечные пятна на месте заражения
2	MR Среднеустойчивый	Мелкие пустулы в количестве до 10, часто без спороношения (не вскрываются)
3	WS Слабовосприимчивый	Мелкие и средние пустулы в количестве больше 10, хлоротичные пятна
4	MS Средневосприимчивый	Средние отдельные пустулы диаметром 0,2 мм в количестве больше 20 со слабой споруляцией
5	S Восприимчивый	Крупные бархатистые пустулы диаметром 0,4 мм, зрелые урединиоспоры свободно высыпаются, наблюдаются сливающиеся хлоротичные пятна
6	VS Сильновосприимчивый	Крупные бархатистые сливающиеся пустулы диаметром 0,6 мм с небольшим хлоротичным пятном под ними или без него, обильно спорулирующие

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом однофакторного дисперсионного анализа [11] с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2010 и Statistics 6.1.

Результаты и обсуждение. За период 2018–2024 гг. коллективом лаборатории иммунитета в суммарной выборке изолятов возбудителя из разных регионов РФ были идентифицированы в общей сложности 515 биотипов с присвоением каждому трёхзначного кода обозначения. Их количество по годам зависело от погодных условий. В таблице 2 представлены основные биотипы, преобладающие в этой совокупной выборке изолятов. Чаще других среди изолятов, собранных в 2018 и 2019 гг., выявлялся биотип с кодовым номером 300, а в период с 2020 по 2024 гг. – 700 (табл. 2).

Полученные результаты подтвердили необходимость ежегодного отслеживания появления новых биотипов возбудителя ржавчины подсолнечника и их соотношения в выборках изолятов при выборе инокулята для селекции устойчивых генотипов подсолнечника.

На основании проведённых исследований для фенотипической оценки устойчивости растений подсолнечника использовали чистые клоны спор из отдельных урединий с идентифицированным кодом вирулентности 700, как преобладающего в большинстве изученных выборок изолятов возбудителя.

Клоны спор из отдельных урединий получали путём заражения семядольных листьев пятидневных проростков подсолнечника. Для этого семянки проращивали в рулонах фильтровальной бумаги при температуре 25–27 °С. На третьи сутки проростки освобождали от лузги, отсекали корни, выравнивая их высоту, и опускали гипокотилями в воду, помещая в отверстия перфорированных крышек пластиковых чашек Петри диаметром 9 см (рис. 1).

Таблица 2

Соотношение биотипов возбудителя ржавчины в выборках изолятов, собранных в разных регионах РФ в 2018–2024 гг.

Table 2

The ratio of rust pathogen biotypes in samples of isolates collected from different regions of the Russian Federation in 2018–2024

Год	Количество, шт.		Присутствие биотипа в выборке, %
	изолятов	биотипов	100	300	700	740	остальные
2018	37	4	19,3	46,3	22,5	0	11,9
2019	60	9	12, 6	58,1	23,7	0	18,2
2020	63	11	2,4	11,6	64,3	7,9	13,8
2021	94	15	3,7	9,6	51,8	11,7	23,2
2022	125	21	0	15,3	49,9	7,6	27,2
2023	122	23	0	14,8	40,2	12,3	32,7
2024	14	8	0	0	28,6	0	71,4

Рисунок 1 – Схема получения клонов спор из отдельных урединий возбудителя ржавчины Puccinia helianthi Schwein. при заражении пятидневных проростков восприимчивого сорта подсолнечника (ориг.)

Fig. 1 – Scheme for obtaining spore clones from the isolated uredinia of the rust pathogen Puccinia helianthi Schwein. upon infection of five-day-old seedlings of a susceptible sunflower variety (orig.)

Проростки выдерживали двое суток до полного раскрытия семядольных листьев в условиях 16-часового фотопериода при температуре 25–27 °С. Подготовленные пятидневные проростки заражали урединиоспо-рами из отдельной пустулы. Урединио-споры снимали стерильным стеклянным шпателем и наносили на увлажнённые семядольные листья. Чашки с заражёнными проростками помещали во влажную камеру и выдерживали сутки при температуре 18– 20 °С без света. Затем культивировали при температуре 25–27 °С в условиях 16-часового фотопериода до появления симптомов поражения (рис. 1).

Образовавшиеся на проростках уреди-ниоспоры собирали, стряхивая на пергаментную бумагу, и помещали в криопробирку для хранения или использовали сразу для заражения. При недостаточном для заражения количестве спор их размножали описанным выше способом на восприимчивом сорте.

Для оценки устойчивости селекционного материала разработали способ выращивания растений в пластиковых растильнях размером 22,0 × 13,0 × 3,5 см на субстрате минеральная вата [11], которую покрывали фильтровальной бумагой и увлажняли. Семянки подсолнечника селекционных образцов проращивали в рулонах увлажнённой фильтровальной бумаги. Трёхдневные проростки раскладывали рядами, накрывали корни полосками фильтровальной бумаги, разделяя ими образцы селекционного материала. В одну растильню помещали пять образцов селекционного материала по 15– 20 проростков каждого, 6-й ряд – контрольный вариант, восприимчивый сорт ВНИИМК 8883 улучшенный (рис. 2).

Заражали семядольные листья пятидневных проростков.

Исключительное значение при искусственном заражении имеет концентрация споровой суспензии. Её необходимо контролировать, так как слишком высокая инфекционная нагрузка действует отрицательно на проявление симптомов: на листьях могут развиваться некрозы, а типичные симптомы – отсутствовать.

Установлено, что для биотипа 700 необходимо 3 мг жизнеспособных урединиоспор на 10 мл воды для заражения 100–110 проростков подсолнечника, размещённых в одной растильне. При такой инфекционной нагрузке количество сформированных уре-диний достоверно на 5%-ном уровне значимости превышает другие варианты концентрации спор в суспензии (табл. 3).

Рисунок 2 – Подготовленные растильни с трёхдневными проростками селекционных образцов подсолнечника для заражения возбудителем ржавчины Puccinia helianthi Schwein.

(ориг.)

Fig. 2 – Prepared germinating dishes with three-day-old seedlings of sunflower breeding samples for infection with the rust pathogen Puccinia helianthi Schwein. (orig.)

Таблица 3

Среднее количество урединий биотипа 700 на семядольном листе проростков подсолнечника в зависимости от инфекционной нагрузки

Table 3 Average number of biotype 700 uredinia on the cotyledon leaf of sunflower seedlings depending on the infection load

Инфекционная нагрузка, мг на 10 мл воды	Среднее количество урединий на семядольном листе
1	2,7
2	6,8
3	18,2
4	16,5
5	9,6
НСР 05	8,21

Важное значение для успешного заражения имеет способ нанесения инокулята. Известно, что для зерновых культур разработаны следующие методы инокуляции ржавчинными грибами: опудривание смесью урединиоспор с тальком, опрыскивание водной или масляной суспензией уре-диниоспор, инжекторный (использование шприца для локального нанесения инокулята в воронку выходящего в трубку листа), микрокамер или расстановки сосудов с ранее зараженными растениями среди изучаемых [12; 13].

Эти методы не пригодны для растений подсолнечника потому, что его листья отличаются строением от листьев зерновых культур. Пластинка листа подсолнечника тонкая, менее 0,5 мм [14], и при нанесении талька или муки в смеси с урединиоспо-рами лист засыхает.

При заражении большого количества оцениваемого селекционного материала подсолнечника наиболее приемлемым является опрыскивание водной суспензией спор. Этот способ обеспечивает равномерное распределение спор с обеих сторон листа. Известно, что у листьев подсолнечника устьиц на нижней стороне листа в 1,5–2 раза больше, чем на верхней [12]. В наших экспериментах суспензию спор наносили на влажные семядольные листья путём распыления (рис. 3).

Первичный визуальный осмотр иноку- лированных растений проводили на 5-е сутки. Учитывали продолжительность латентного периода возбудителя ржавчины у разных генотипов подсолнечника.

После обнаружения симптомов заболевания проводили учет интенсивности поражения образцов селекционного материала и типа реакции в соответствии с разработанной для этого шкалой (табл. 2).

Анализ результатов оценки устойчивости 20 генотипов подсолнечника к поражению возбудителем ржавчины с применением новой технологии в сравнении с модифицированной методикой 80-х годов прошлого века, при которой заражается вторая пара настоящих листьев, у 14-дневных растений, выращенных обычным способом, в грунте показал их сопоставимость как по степени поражения, так и по типу реакции (табл. 4).

Анализ данных таблицы 4 показывает: заражение и выращивание различающихся по устойчивости к ржавчине 20 генотипов подсолнечника двумя разными методами привело к одинаковым результатам, что свидетельствует о применимости разработанной нами технологии для оценки устойчивости селекционного материала подсолнечника к возбудителю болезни. Изученные генотипы подсолнечника достоверно на 5%-ном уровне значимости различались по степени поражения при оценке как по новой технологии, так и по старой.

Рисунок 3 – Проростки подсолнечника, выращенные в пластиковых растильнях на увлажнённом субстрате минеральная вата:

1) перед инокуляцией споровой суспензией возбудителя ржавчины; 2) во влажной камере после инокуляции;

3) с урединиями гриба на семядольных листьях (ориг.)

Fig. 3 – Sunflower seedlings grown in plastic germinating dishes on a moist mineral wool substrate: 1) before inoculation with a spore suspension of the rust pathogen; 2) in a humidity chamber after inoculation;

3) with fungal uredinia on cotyledon leaves (orig.)

Таблица 4

Результаты оценки устойчивости образцов подсолнечника при искусственном заражении биотипом 700 возбудителя ржавчины (1 – настоящих листьев у 14-дневных растений, 2 – семядольных у пятидневных проростков)

Table 4

Results of assessing the resistance of sunflower samples to artificial infection with biotype 700 of the rust pathogen (1 – true leaves of 14-day-old plants, 2 – cotyledons of five-day-old seedlings)

Генотип, №	Среднее количество пораженных растений, %		Среднее количество уре-диний на листе, шт.		Тип реакции*
	1	2	1	2	1	2
1	100	100	19,2	15,6	WS	WS
2	100	96,8	24,3	25,1	MS	MS
3	100	98,7	27,6	24,8	MS	MS
4	86,6	81,2	2,3	2,7	MR	MR
5	60,3	59,6	4,6	3,8	MR	MR
6	80,1	79,4	3,2	3,7	MR	MR
7	100	100	15,4	12,9	WS	WS
8	100	98,6	56,6	53,8	VS	VS
9	100	94,8	48,3	46,7	VS	VS
10	62,4	63,2	14,2	11,8	WS	WS
11	0	0	0	0	VR	VR
12	60,5	58,3	4,3	3,7	MR	MR
13	86,3	82,6	23,4	21,9	MS	MS
14	29,1	31,3	3,4	3,7	MR	MR
15	20,4	21,5	7,9	6,5	MR	MR
16	30,6,	32,4	17,6	13,9	WS	WS
17	50,7	50,9	16,2	14,8	WS	WS
18	75,4	76,2	27,3	22,9	MS	MS
19	100	100	2,3	1,8	MR	MR
20	12,7	10,9	4,5	3,7	MR	MR
Контроль-ВНИИМК 8883 улучш.	100	100	53,3	51,7	VS	VS
НСР 05			9,56

*тип реакции: WS – слабовосприимчивый; MS – средневосприимчивый; MR – среднеустойчивый; VS – сильновосприимчивый

Заключение. Предлагаемая новая технология оценки устойчивости селекционного материала подсолнечника к возбудителю ржавчины ( Puccinia helianthi Schwein.) отличается от обычно применяемой следующими элементами:

• 1.    Искусственное заражение растений осуществляется чистым клоном урединио-спор известной кодовой принадлежности.

• 2.    Клонирование и размножение спор нужной вирулентности осуществляется на семядольных листьях проростков подсолнечника.

• 3.    У изучаемых генотипов подсолнечника заражают семядольные листья в фазе

пятидневных проростков, которые выращивают в лабораторных условиях в пластиковых растильнях на увлажнённом субстрате минеральная вата при регулируемых температуре и освещении.

Применение этой лабораторной технологии, помимо сокращения на 9 дней срока оценки устойчивости селекционного материала, даёт возможность исключить трудоёмкие процедуры выращивания растений в сосудах с почвой и последующего ухода за ними. Новая технология также позволяет разместить большее количество образцов оцениваемого материала подсолнечника в камере искусственного климата.