Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение антибактериальных и противогрибковых свойств природного пептида

Антимикробные пептиды (AMП) представляют собой разнообразный класс молекул, встречающихся в природе и экспрессирующихся во всех организмах, включая млекопитающих [1]. Они являются незаменимыми компонентами врожденного иммунитета и обладают широким спектром активности против бактерий, грибков, дрожжей, вирусов, а также онкоклеток [2]. Как правило, АМП имеют относительно небольшую длину - от 10 до 100 остатков аминокислот, являются катионными, могут быть амфифильными, гидрофобными и гидрофильными [3]. АМП кодируются в геноме в виде препропептидов, где сигнальный пептид находится на N -конец, а домен антимикробного пептида находится на С -конце [4]. АМП являются альтернативой традиционным антибиотикам, так как обладают широким спектром действия и у микроорганизмов не развивается резистентность к пептидам. Первый АМП-препарат грамицидин А, выделенный из почвенных бактерий Bacillus subtilis , был произведен промышленным способом в 1940-х гг. Низин из Lactococcus lactis впервые был представлен в 1953 г. в качестве противомикробного средства и сейчас находит широкое применение в качестве безопасного пищевого биоконсерванта. Биоинженерные варианты низина эффективны при инфекционных заболеваниях, вызванных S. pneumoniae, энтерококками , C. Difficile , а также они выступают синергетиками по отношению к антибиотикам, таким как ципрофлоксацин и ванкомицин [5]. Пептиды полимиксин B (открытый в 1955 г.), полимиксин E (более известный как колистин, открытый в 1962 г.) и даптомицин (открытый в 2003 г.) используются в качестве антимикробных препаратов [6].

АМП классифицируют на основе их происхождения, свойств последовательности, структурных свойств, биологической активности и молекулярных мишеней воздействия [7]. Поскольку структурная организация АМП играет важную роль в механизме их действия [8], то целесообразно рассмотреть классификацию на основе структуры пептидов. АМП можно разделить на 4 класса в зависимости от их конформационной организации: 1) а-спираль; 2) в-слой; 3) одновременно а-спираль и в-слой (т. е. смешанный тип); 4) без а-спирали и в-слоя [9].

Процентное соотношение существующих пептидов с 1) а-спиралью, 2) в-слоем, 3) а-спи-ралью и в-слоем и 4) без а-спирали и в-слоя пептиды среди известных 3D-структур составляет 69, 12, 16 и 3 % соответственно. Большинство известных АМП являются катионными, незначительное число пептидов несет нейтральный или анионный заряд. Так, АМП с а-спиралью, в-слоем в структуре имеют средний заряд от +2 до +3,60, смешанные пептиды имеют более высокий средний заряд - на уровне + 5,40 [9].

В части структуры аминокислотной последовательности а-спиральные пептиды имеют в составе лизин, лейцин и аланин, тогда как пептиды с в-слоем имеют в составе цистеин и аргинин. Примечательно, что все 4 класса содержат высокие доли глицина, что позволяет предположить, что он важен как для структурной поддержки, так и для гибкости пептидов для выполнения антимикробных функций. а-спиральные пептиды представляют собой самый большой класс АМП и являются наиболее изученными [10].

Ввиду того что в статье описаны результаты исследования а-спиральных противомик-робных пептидов, целесообразно остановиться на механизме их действия.

Многие а-спиральные противомикробные пептиды линейны и амфипатичны, состоят из катионных и гидрофобных аминокислот, пространственно разделенных на противоположных сторонах спирали [10]. Яркими примерами этого класса являются кателицидины млекопитающих [11]. Эти пептиды проявляют сильное сродство к мембранам, тем самым ставя под угрозу стабильность β-слоя, нарушая организацию мембраны и (или) формируя поры. Первоначально пептиды находятся параллельно поверхности мембраны клетки, затем при увеличении концентрации вращаются вокруг мембраны, чтобы внедриться в мембрану под определенным углом наклона. Человеческий кателицидин LL-37 может принимать частично спиральную структуру в растворе, следовательно, заставляя его олигомеризоваться с другими пептидами, чтобы скрыть гидрофобную поверхность. Помимо индивидуальной активности, спиральные пептиды с различными последовательностями могут действовать синергически, что приводит к усилению цитолитического и антибактериального эффектов [12].

Путем посттрансляционной модификации зрелый (активный) биопептид образуется путем протеолитического расщепления белка [13].

Молочные белки являются легкодоступным источником ценных пептидов с разнообразными типами биологической активности, такими как антимикробная, гипотензивная, антиоксидантная, антитромботическая и иммуномодулирующая [14].

Так, авторами [15] в результате двустадийного гидролиза соевого белка пепсином и трипсином получены пептиды с антиоксидантными свойствами, установлены оптимальные параметры гидролиза соевого белка для каждого фермента. Ученые [16] доказали, что биопептиды могут быть выделены из мяса и мясопродуктов. В исследовании авторов [17] установлены оптимальные параметры гидролиза яичного альбумина для выделения биопептидов.

Цель работы – теоретически обосновать антимикробную и противогрибковую активность природного пептида, выделенного из пепсинового гидролизата молозива коров, и подтвердить его эффективность в эксперименте in vitro .

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследований использован пептид, выделенный из пепсинового гидролизата молозива коров. Пептиду дано условное название mpR2 . Молекулярно-массовое распределение пептида оценивали масс-спектрометрическим методом и идентифицировали методами MALDI-TOF и MS масс-спектрометрии на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex («Bruker», Германия). Масс-спектры анализировали с помощью программы Mascot, опция Peptide Fingerprint («Matrix Science», США) с использованием базы данных Protein NCBI. Микросеквенирование осуществляли при помощи секвенатора MiSeq (Illumina, США) и системы для высокопроизводительного секвенирования (PGM Ion Torrent, США).

Моделирование пространственной структуры выделенного пептида осуществляли с помощью программы молекулярного моделирования Schrodinger Maestro (США).

Антимикробную активность пептида исследовали диско-диффузионным методом на грамположительных и грамотрицательных бактериях. В качестве тест-штаммов использовали Escherichia coli и грамположительную бактерию Bacillus subtilis .

Культивирование штаммов бактерий проводили на плотной питательной среде LB (агар – 1,5 %, триптон – 1, дрожжевой экстракт – 0,5, NaCl – 1 %) и жидкой питательной среде LB (триптон – 1 %, дрожжевой экстракт – 0,5, NaCl – 1 %) при температуре 37 ºC.

Диффузионный метод определения антимикробной активности гидролизатов заключался в следующем. Тест-штамм высевали на агаризованную питательную среду газоном, и одновременно на газон помещали пептид. В качестве контроля использовался бумажный диск с питательной средой, в качестве препарата сравнения – диск с антибиотиком (канамицин из стандартного набора). Чашки Петри инкубировали при температуре, соответствующей оптимальной температуре роста каждого тест-штамма микроорганизма, в течение 24,0 ± 0,5 ч. Результаты учитывались по наличию и размеру (в мм) прозрачной зоны отсутствия роста микроорганизмов вокруг диска.

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунке представлены двухмерная (а) и трехмерная (б) структуры пептида mpR2 .

а

б

Рисунок – Двухмерная (a) и трехмерная (б) структуры пептида mpR2

При исследовании первичной структуры пептида с условным названием mpR2 установлено, что он состоит из 60 аминокислот и в следующей последовательности: LRQLSVVVAYKGKDVGLNDCEEADRHKSSHRDEVSSFRRNSYSIYENHGP SAKCAREVGR, и имеет молекулярную массу 23 кДа. Согласно базе данных, Protein NCBI сходен с пептидом под названием « EV861652 protein, sus scrofa », функции которого не исследованы.

Пептид mpR2 наряду с другими аминокислотами состоит из 5 аминокислотных остатков лизина, 2 лейцина и 5 аланина, что согласуется с базой данных APD3, состоящей из более чем 3 000 записей о структурно-аннотированных природных пептидах, из которой следует, что антимикробные α-спиральные пептиды имеют в составе лизин, лейцин и аланин [18].

По данным [19], в состав антимикробных пептидов входят специфические аминокислоты, такие как аргинин, глицин и гистидин. Их антимикробная активность обеспечивается водородными связями или силами Ван-дер-Ваальса между пептидами и мембранными липидами, независимо от водородных связей между остатками.

В антимикробном пептиде, который проявляет активность против бактерий и вируса SARS-CoV-2, по данным [20], присутствуют аминокислотные последовательности VV, VA и AK, которые имеются в исследуемом пептиде mpR2 .

При моделировании 2-и 3-D структур установлено, что пептид mpR2 относится к α-спиральным и имеет заряд +2, гидрофильность (гидрофобность) – +73,70 Ккал×моль^-1, что позволяет сделать предположение о его антибактериальных свойствах, и согласуется с исследованием [21]. В исследовании [22] установлено, что АМП обычно содержат несколько основных сайтов, которые придают им суммарный положительный заряд при изоэлектрической точке близкой к нейтральной или слабощелочной, что подтверждается результатами наших исследований. Так, у пептида mpR2 изоэлектрическая точка на уровне 8,90 и имеется гидрофобный домен. По данным [23], электростатический заряд является еще одним движущим фактором, который влияет на притяжение пептида к микробной клетке и сворачивание пептида на границе раздела липид-пептид и большинство антимикробных пептидов имеют катионную природу с суммарным положительным зарядом от + 2 до + 9.

Теоретическое обоснование антимикробного действия пептида согласуется с исследованиями [24], в которых установлено, что гидролиз трипсина и пепсина способствует образованию большинства признанных АМП.

В таблице представлена антимикробная и противогрибковая активность пептида mpR2 .

Таблица

Антимикробная и противогрибковая активность пептида mpR2

Наименование образца	Диаметр зоны лизиса, мм
	E. coli ATCC 25922	B. subtilis	C. Albicans
Пептид mpR2	7	9	5
Контроль	0	0	0
Антибиотик канамицин	22	24	не исследовали
Противогрибковый препарат флуконазол	не исследовали	не исследовали	26

Установлено, что пептид mpR2 обладает противомикробной активностью в отношении бактерий E.coli ATCC 25922 и B. Subtilis, а также противогрибковой активностью в отношении дрожжевого гриба C. Albicans . Следует отметить, что исследуемая активность пептида значительно ниже по сравнению с антибиотиком канамицином и противогрибковым препаратом флуканазолом.

Таким образом, теоретически прогнозируемая противомикробная активность пептида mpR2 подтверждена экспериментально.

Заключение

Несмотря на продолжающиеся усилия по разработке новых антибиотиков, возникновение резистентности у бактерий ограничивает эффективность их применения, что имеет значительные последствия для здоровья населения. По этой причине в последние годы исследования все больше фокусируются на выявлении альтернативных стратегий. В этом контексте особое внимание уделяется использованию АМП природного происхождения.

Проведены исследования по изучению взаимосвязи между структурной организацией и активностью АМП, вследствие чего из трипсинового гидролизата молозива коров выделен пептид с условным названием mpR2 , который идентифицирован по базе данных Protein NCBI как пептид «EV861652 protein, sus scrofa» с функциями, которые ранее не были исследованы.

На основании идентификации аминокислот в пептидной последовательности и определении их числа, а также на основании молекулярной массы пептида, заряда, изоэлектрической точки и гидрофильности сделано предположение, что исследуемый пептид относится к антимикробным катионным α-спиральным пептидам.

Экспериментально доказано, что исследуемый пептид обладает противомикробным и антигрибковым действием, но более низким в сравнении с антибиотиком и противогрибковым препаратом. Следовательно, можно рекомендовать использование исследуемого пептида в качестве дополнительного антибактериального и противогрибкового средства при условии доказательства его биодоступности и отсутствия токсичности.