Тератозооспермия и кариопатологические изменения клеток крови у жителей Западной Сибири, инфицированных анаплазмами (Anaphma phgocytophilum)

последние годы спектр клещевых инфекций существенно расширился. Если ранее ученые полагали, что анаплазмоз, вызванный Ana-plasma phagocytophilum, характерен в основном толь ко для домашних животных, то в настоящее время диагноз анаплазмоза очень часто ставят человеку, постарадавшему от укуса клеща. Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) относится к острым лихорадочным заболеваниям с трансмиссивным путем передачи, переносчиками которого являются ик-содовые клещи. Возбудителем заболевания является Anaplasma phagocytophillum, относящаяся к роду Anaplasma, семейства Anaplas-mataceae. По данным, представленным Е.Н. Ильинских с соавт., первый случай ГАЧ зарегистрирован в Томской области в 2006 году и, начиная с 2013 года, в области отмечен резкий подъем заболеваний, вызванных анаплазмами, при этом среди невирусных клещевых инфекций, поражающих человека в 72,1% случаев, наблюдается ГАЧ, а в 27,9% – моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ) [1].

При анализе 228 сывороток крови у обратившихся по поводу укуса клеща в серопрофилактические пукты г. Тюмени в 34,2% случаях были обнаружены анаплазмы (ГАЧ) и в 28,9% эрлихии (МЭЧ) [2]. Исследование, проведенное С.И. Логвиновым на крупном рогатом скоте, свидетельствует о способности некоторых видов анаплазм индуцировать в клетках крови микроядра, возникающие в результате отставания в анафазе митоза фрагментов или целых хромосом [3]. Показано также влияние анаплазм на репродуктивные функции животных, сопровождаемые изменениями структуры семенников и патологией морфологии сперматозоидов [4-5]. Исследований, свидетельствующих о способности ана-плазм индуцировать цитогенети- ческие и кариопатологические аберрации в соматических клетках и патологические изменения сперматозоидов у человека, в доступной литературе авторы не обнаружили.

Настоящая работа посвящена исследованию тератозооспермии и кариопатологических изменений клеток крови у больных и переболевших анаплазмозом, а также у лиц с хроническим бессимптомным носительством анаплазм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обследованы 16 лиц мужского пола больных анаплазмозом, находящихся на лечении в инфекционных отделениях больниц в г. Тюмени и г. Томске. Материалом для кариопатологического анализа послужила кровь из локтевой вены и семенная жидкость пациентов. Больных обследовали во время госпитализации (1-2 день начала заболевания), через 1 и 3 месяца после

выписки из стационара. Кроме того аналогичный анализ однократно проведен у 18 мужчин, у которых методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) при плановом обследовании работников различных учреждений выявлено бессимптомное носительство анаплазм. Возраст обследованных составил, в среднем, 32,5±4,5 лет. Все пациенты в течение одного года не подвергались лучевым процедурам и до начала заболевания не получали лекарственную терапию. Большинство из обследованных предъявляли жалобы на отсутствие либидо, резкую утрату полового влечения, что стало одной из причин для изучения у них патологических изменений сперматозоидов в семенной жидкости. В группу контроля были включены 14 здоровых доноров станции переливания крови аналогичной возрастной группы. Предварительно у каждого обследованного было взято информированное согласие на проведение настоящего исследования, которое соответствовало требованиям Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава России от 19.06.2003 п. № 266.

Диагноз заболевания устанавливали на основании клинической картины и эпидемиологических данных, темнопольной микроскопии мазков крови с выявлением ин-трацитоплазматических морул ана-плазм в инфицированных нейтрофилах, а также положительных результатов серологических тестов (иммуноферментный анализ). Для выявления антител к ГАЧ (Ig М и Ig G) использовались диагностические тест-системы фирмы «Омникс» (Санкт-Петербург). Для подтверждения диагноза у всех обследованных с помощью ПЦР определялось наличие праймеров на участок ДНК 16S субъединицы рРНК возбудителя с помощью набора для выделения геномной ДНК из бактерий компании «Синтол» (Москва). Синтез олигонуклеотидов производился на автоматическом ДНК/РНК синтезаторе ASM1000 ("Биоссет", Новосибирск). Очистка проводилась в полиакриламидном геле. Амплификацию выполняли на приборе типа «Терцик-МС2» (Москва) с применением термостабильной Taq-полимеразы ("СибЭнзим", Новосибирск) согласно рекомендациям фирмы-производителя полимеразы. Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Документирование результатов осуществляли на видиоси-стеме «Vitran» (Биоком).

У всех обследованных пациентов проведены кариопатологиче-ские исследования, выявившие следующее: изменения интерфазных ядер в моноцитах крови с регистрацией числа клеток бинуклеаров, с микроядрами и протрузиями, хро-матинолизом, фрагментолизом, ка-риорексисом, кариопикнозом, ка-риолизисом и вакуолизацией ядра; гиперсегментированность, хрома-тинолиз и фрагментолиз ядра нейтрофилов крови; наличие микроядер в эритроцитах крови; присутствие патологических изменений размера, формы, акросомальной области сперматозоидов, дефекты числа головок, шейки, хвостовой области в мазках семенной жидкости. Для морфологически нормального сперматозоида характерна овальная форма головки, длина которой составляет 5-6 мкм, ширина 2,5-3,5 мкм, акросомальный участок занимает от 40 до 70% площади головки, при этом отсутствуют аномалии шейки, хвоста и срединного отдела. У исследуемых пациентов фиксировались выраженные изменения размеров головки сперматозоида, что подтверждалось путем измерения окуляр-микрометром.

Изменения формы, дефекты акро-сомальной области, удвоение головки сперматозода, а также аномалии шейки и хвоста оценивались визуально согласно методических указаний ВОЗ и строгих критериев Крюгера [6,7]. Микроскопически был проведен анализ не менее 10 000 моноцитов, нейтрофилов, эритроцитов крови и сперматозоидов. Методические особенности приготовления препаратов и их анализ изложены нами ранее [8]. Кроме того семенная жидкость изучена также на предмет лейкоцитоспермии. Особое внимание при этом обращали на присутствие в сперме инфицированных нейтрофилов.

Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATIS-TICA v.10.0 и BIOSTAT (Primer of Biostatistic version 4.03). Все количественные показатели обрабатывали с применением корреляционного анализа по Спирмену и t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова-Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность [9]. Различия сравниваемых результатов (X±m, где X – выборочное среднее арифметическое, m – ошибка среднего арифметического) считались достоверными при достигнутом уровне значимости p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что в первые дни заболевания анаплазмозом наблюдается значимо повышенный уровень по сравнению с группой контроля практически всех регистрируемых показателей патологий клеток крови и сперматозоидов (табл. 1).

Наличие вакуолизации в ядре моноцитов крови указывает на глубокие изменения в клетке и тяжелую степень патологического процесса. Вакуолизация часто сочетается с другими структурными изменениями клетки. Ранняя деструкция ядра моноцита цитологически начинается с образования перинуклеарной вакуоли [10]. В группе контроля число моноцитов с перинуклеарной вакуолью составило 0,71±0,33‰, у пациентов основной группы на 1-2 день заболевания – 5,18±0,73‰ (p<0,01), на 30 день – 4,31±0,53‰ (p<0,01). Апоптотический процесс распада хроматина ядра моноцита может выглядеть как хроматинолиз моноцита, при этом хроматин теряет свою нормальную структуру и рас- творяется. Ядро окрашивается в светлый цвет, контуры его сохраняются. В группе контроля указанный тип кариопатологических изменений составил 1,82±0,53‰, у пациентов основной группы в начале заболевания – 6,12±0,53‰ (p<0,01), через месяц после начала заболевания – 4,42±0,51(p<0,05). Фрагментоз моноцитов представляет собой процесс, при котором от ядра отделяются отдельные фрагменты, часто связанные с ядром тонкими нитями базихроматина. Частота выявления подобных моноцитов с фрагменто-зом в первые дни госпитализации пациентов основной группы составила 5,02±0,73‰ при значении 0,73±0,20‰ в группе контроля (p<0,001). Повышенный уровень фрагментоза моноцитов сохранялся у пациентов основной группы и через месяц наблюдения (p<0,05). Кариолизис, представляющий собой растворение части ядра, контуры которого становятся нечеткими, размытыми, составил 0,23± 0,12‰ в группе контроля и 2,56± 0,54‰ у пациентов на 1-2 день болезни (p<0,001). Частота выяления моноцитов с кариорексисом или распадом ядра на отдельные не связанные друг с другом части, зачастую являющимся заключительным этапом гибели клетки и образующийся при формировании многогруппового аномального митоза [10], составила в группе контроле 0,12±0,10‰; в основной группе – на 1-2 день наблюдения 2,62±0,61‰ крови с патологическими изменениями и показатели тератозооспермии у , и здоровых доноров

Таблица 1. Частота выявления клеток людей, инфицированных анаплазмами

	Срок взятия материала (дней после начала заболевания)			Бессимптомные	Здоровые
Число клеток	1-2 дня	30 дней	60 дней	носители анаплазм	доноры
с патологическими					(контроль)
изменениями ( в ‰ )	n=16	n=16	n=15	n=18	n=14
	Показатели кариопатологических изменений в моноцитах крови (в ‰ )
Микроядра и протрузии	10,81 ± 1,21***	8,34 ± 0,63*	5,35 ± 0,61*	9,38 ± 0,56**	3,32 ± 0,21
Хроматинолиз	6,12 ± 0,53**	4,42 ± 0,51*	3,29 ± 0,73	3,97 ± 0,59	1,82 ± 0,53
Фрагментоз	5,02 ± 0,73***	1,94 ± 0,33 *	0,75 ± 0,41	1,78 ± 0,49	0,73 ± 0,20
Двуядерные клетки	4,34 ± 0,64**	1,52 ± 0,25*	0,42 ± 0,22	1,16 ± 0,28	0,30 ± 0,22
Кариорексис	2,62±0,61***	1,33 ± 0,21***	0,34 ± 0,10	0,39 ± 0,18	0,12 ± 0,10
Кариолизис	2,56 ± 0,54***	0,54 ± 0,20	0,49±0,32	1,67±0,39	0,23 ± 0,12
Кариопикноз	0,12 ± 0,04**	0,11 ± 0,02	0,18 ± 0,14	0,16 ± 0,13	0,62 ± 0,13
Перинуклеарные вакуоли	5,18 ± 0,73**	4,31 ± 0,53**	1,44 ± 0,83	1,82 ± 0,34	0,71±0,33
Всего	37,12 ± 5,22***	22,73 ± 3,46**	12,64 ± 1,91	18,72 ± 2,45**	7,13 ± 1,21
Показатель кариопатологических изменений в сегментоядерных нейтрофилах крови (в ‰ )
Гиперсегментированность ядра	6,34±0,48*	4,56±0,49*	0,68±0,14	0,53±0,52	0,49±0,14
Хроматинолиз	5,33±0,57*	5,32±0,66*	0,79±0,09	0,81±0,41	0,78±0,07
Фрагментоз	4,13±0,45*	3,46±0,24*	0,58±0,12	0,51±0,34	0,59±0,11
Всего	15,80±1,9***	13,34±1,8***	2,05±0,34	1,85±0,67	1,86±0,57
Показатель кариопатологических изменений эритроцитов крови (в ‰ )
Эритроциты с микроядром	0,18±0,06*	0,15±0,04*	0,01±0,01	0,16±0,05*	0,01±0,01
Показатели тератозооспермии (в ‰ )
Дефекты Размера	156,5±11,2***	68,7±5,9***	37,1±5,6	40,5±7,6	28,6±3,6
головки Формы	92,9±8,9***	33,7±5,1**	21,6±4,5	27,6±3,4	17,2±2,2
спермато- Акросомальной зоида     области	115,6±9,9***	56,3±8,1***	20,4±6,2	31,4±7,2	21,4±3,6
Число головок	63,5±8,2***	33,9±3,1***	14,3±2,4	23,3±2,9	12,6±2,9
Дефекты шейки	79,3±7,1***	79,6±6,2***	37,2±5,1	44,2±5,6	36,9±5,7
Дефекты хвоста	39,7±4,5	41,5±5,0	41,4±6,6	48,4±7,6	32,4±4,8
Всего	547,5±18,9***	313,7±16,8***	172,0±11,5	215,4±13,6	149,1±19,8

Примечание. Значимые различия показателей у обследованных пациентов по сравнению с группой контроля отмечены звездочками: одной – при р <0,05; двумя – при p <0,01; тремя – при p <0,001.

( p <0,001), на 30 день – 1,33±0,21 ( p <0,001).

У пациентов основной группы в период госпитализации и через 1-3 месяца после выписки из стационара, а также при бессимптомном носительстве анаплазм отмечено снижение числа моноцитов крови с кариопикнозом по сравнению с группой контроля, что может свидетельствовать о процессах деконденсации хроматина в указанных клетках [11]. Обследование пациентов основной группы через 3 месяца после выписки из стационара показало нормализацию большинства анализируемых показателей за исключением частоты встречаемости моноцитов с микроядрами и протрузиями. При бессмптомном носительстве анаплазм значимо, по сравнению с группой контроля, возрастало число моноцитов с микроядрами и протрузиями ( p <0,01), другие показатели кариопатологи-ческих изменений моноцитов были в пределах контрольных значений.

Анализ микроядер и протрузии позволяет сделать вывод о том, что анаплазмы способны вызывать поражения хромосомного аппарата клеток крови. Причем значимое повышение такого рода нарушений наблюдается не только в ядросодержащих клетках крови – моноцитах, но и в эритроцитах. Совершенно очевидно, что в этом случае изменения должны возникать на ранних этапах эритропоэза в эритробластах. Поскольку большинство наблюдаемых микроядер в моноцитах и эритроцитах у основной группы больных имеют небольшие размеры (менее 3 микрон), то логично предположить о том, что этот инфекционный агент опосредовано индуцирует аберрации хромосом и образовавшиеся ацентрические фрагменты формируют микроядра. Имеется мнение, что в основе патогенного действия Anaplasma phago-cytophilum лежит повышение активности катепсина L в нейтрофилах крови, который способствует возникновению одноцепочечных разрывов ДНК и образованию микроядер [12,13]. К другому типу цитогенетических нарушений, возникающем при инфицировании микоплазмами, следует отнести существенное возрастание числа двуядерных моноцитов. Анализ этих клеток показал идентичность размеров, структуры хроматина и интенсивности окраски между ядрами в би-нуклеаре и это может свидетельствовать в пользу вывода о том, что такие клетки формируются в результате блокады цитокинеза.

Анализ морфологических изменений сперматозоидов в период начала госпитализации показал наличие значительного увеличения в семенной жидкости больных числа сперматозоидов с дефектами головки. Также по сравнению с группой контроля, отмечен рост числа сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, с аномалиями ак-росомальной области, двойной головкой, дефектами шейки, при этом число сперматозоидов с дефектами в области хвоста не отмечено. У бессимптомных носителей анаплазм значимого возрастания числа аномальных сперматозоидов по сравнению с группой контроля не наблюдалось.

В своих исследованиях B.L Swift и соавт. впервые описали патологический процесс, протекающий в половых органах самцов овец, зараженных анаплазмами, относящихся к виду Anaplasma marginale [14]. Проводя исследования на животных, искусственно зараженных ана-плазмами, авторы установили снижение у них полового возбуждения при спаривании и ухудшение качества спермы. Изучая морфологию спермиев, они отметили основную патологию – отделение головки, причем количество патологических клеток спермы изменялось прямо пропорционально степени тяжести болезни. После проведения гистологических исследований тканей семенников авторы обнаружили дистрофические изменения разной степени тяжести: недостаток зрелых спермиев, дегенерация сперматид, некротизация сперматид и мульти-нуклеарный фагоцитоз гигантских клеток, процесса дегенерации: ка-риопикноз, вакуолизация клеток семенных канальцев. У новорожденных самцов, рожденных от животных, пораженных анаплазмами, развивается пролиферативный интер-стицеальный орхит с частичным сохранением сперматогенного эпителия.

Как известно, анаплазмоз сопровождается существенными изменениями гуморального и клеточного иммунитета [15]. При проти-воинфекционном иммунитете значительную роль в устранении цитогенетически измененных клеток играет Т-звено иммунитета и естественные клетки-киллеры [16]. Поражение указанного звена иммунитета сопровождается существенным увеличением числа цитогенетически измененных клеток, поскольку в организме больного ослабевает иммунная система, призванная поддерживать цитогенетический гомеостаз организма. Известно, что анаплазмы в виде морул локализуются в нейтрофилах крови. Наши исследования показали наличие в крови больных значимо повышенного числа нейтрофилов с гиперсегментированным ядром и прогрессирующий процесс хрома-тинолиза и фрагментоза ядра клетки. Особенно существенные изменения наблюдались в нейтрофилах при локализации в цитоплазме клетки морул бактерий. Нахождение таких нейтрофилов в сперме позволяет предположить, что высокая гиперферментия этих клеток может вызвать некоторые морфологические изменения сперматозоидов. Кроме того, размножение анаплазм в нейтрофилах приводит к ослаблению иммунных защитных реакций организма, поэтому зачастую анаплазмоз сопровождается оппортунистическими бактериальными, вирусными или грибковыми инфекциями [17]. Поэтому не исключено, что наблюдаемые нами эффекты могут является сочетанным действием разнообразных микст инфекций.

Анализ морфологических изменений сперматозоидов свидетельствует о том, что у больных анаплазмозом наблюдается значительное увеличение в семенной жидкости числа сперматозоидов с дефектами головки. Также по сравнению с группой контроля отмечен рост числа сперматозоидов с изменением размеров и формы головки, с аномалиями акросомальной области, двойной головкой, дефектами шейки. При этом сперматозоидов с дефектами в области хвоста выявлено не было. Особенно значительные изменения морфологии сперматозоидов наблюдались при присутствии в сперме нейтрофилов, несущих морулы бактерий. По мнению S.H. Sinclair и соавт. [18] на сегодняшний день единственными прокариотическими нуклеомодулина-ми, которые непосредственно свя- зываются с ДНК млекопитающих и влияют на окружающий хроматин клеток хозяина, являются нуклео-модулины бактерии семейства Ana-plasmataceae, к которому относится Anaplasma phagocytophilum. Авторы предположили, что нуклеомоду-лины могут действовать широко, влияя на целые геномы соседних не-инфицированных клеток, путем ремоделирования хроматина, изменяя его структурную организацию. Вполне возможно, что именно с этим процессом связаны наблюдаемые нами кариопатологические процессы в клетках крови и изменения морфологии сперматозоидов семенной жидкости, поскольку в настоящем исследовании у пациентов с анаплазмозом выявлено наличие инфицированных нейтрофилов в эякуляте. По мнению P. Thon-neau и соавт. значительный уровень цитогенетических аномалий в соматических клетках является одним из маркеров бесплодности мужчин [19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цитологический анализ клеток крови (моноциты, нейтрофилы, эритроциты) и сперматозоидов эякулята у пациентов с ГАЧ свидетельствует о значимых кариопа-тологических изменениях в данных клетках. Наличие среди измененных клеток крови клеток с микроядрами позволяет сделать заключение о существовании при ГАЧ повышенного уровня цитогенетических повреждений хромосомного аппарата анализируемых клеток. Возрастание числа цитогенетических нарушений в виде микроядер зарегистрированы и у бессимптомных носителей анаплазм. Одновременно, при инфицировании ана-плазмами у пациентов отмечено возрастание показателей тератозо-оспермии в виде патологических изменений головки и шейки сперматозоидов как при ГАЧ, так и у бессимптомных носителей ана-плазм.

Резюме:

Введение. Анаплазмоз относится к острым лихорадочным заболеваниям, передающимися переносчиками, которыми являются иксодовые клещи. Эксперименты на животных показали способность этого инфекционного агента вызывать цитогенетические нарушения и патологические изменения сперматогенеза.

Целью настоящей работы явилось изучение роли гранулоцитарного анаплазмоза, вызванного Anaplasma phagocytophilum у человека, в формировании кариопатологических изменений клеток крови и развитии тератозооспермии у жителей Западной Сибири.

Материалы и методы. Обследованы трехкратно (в начале болезни, через 1 месяц и 3 месяца) 16 больных ГАЧ, а также проведено однократное обследование 18 бессимптомных носителей A. phagocytophilum и 14 здоровых доноров крови. Для микроскопического анализа у всех обследуемых были взяты образцы спермы в эякуляте и периферическая кровь.

Результаты. Цитологический анализ клеток крови у больных ГАЧ свидетельствует о значимых кариопатологических измене-