Термическая обработка проб сыворотки крови как способ повышения чувствительности ИФА в диагностике лейкоза коров

При хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, а также при персистентных инфекциях, в биологических жидкостях организма или на поверхности клеток появляются иммунные комплексы «антиген-антитело» [5, 8, 12]. Антитела, находясь в составе иммунных комплексов, могут участвовать в элиминации инфекционного агента, вызывать гибель инфицированной клетки и даже способствовать усилению инфекции [1]. Согласно исследованиям, проведенным Митиным Ю.А. [4], подобные иммунные комплексы выделенные из сыворотки крови, обладают низкой температурной устойчивостью и могут разрушаться в диапазоне от +38°С до +40°С.

Целью настоящей работы являлась определение влияния термической обработки на титр антител в пробах сыворотки крови и на чувствительность метода ИФА при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Материалы и методы . Пробы сывороток крови получили от коров из разных хозяйств районов Республики Татарстан. Имму-ноферментый анализ исследуемых проб проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке» производства ФКП «Курская биофабрика -фирма «БИОК». Реакция иммунодиффузии в геле агара поставили согласно инструкциям по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота производства ФКП «Курская биофабрика-фирма «БИОК» в Республиканской ветеринарной лаборатории г.Казани. Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ).

Результаты исследований. Для исследований по обнаружению ЦИК, методом слу- чайной выборки, были отобраны, из числа положительно реагирующих в ИФА на лейкоз, пробы сыворотки крови. Пробы смешивали в соотношении 1:1 с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфер (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Действие ПЭГ на белковые растворы сходно с действием органических растворителей, которые могут вызвать осаждение наряду с иммунными комплексами и свободных иммуноглобулинов. Поэтому мы проводили исследование по определению титра анти-ВЛКРС антител в пуле сывороток крови до и после обработки с ПЭГ-6000. В результате было установлено, что после осаждения ЦИК из пула сывороток крови 7%-ным раствором ПЭГ титры противолейкозных антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе.

Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 60оС в течение 1 часа. Титры «связанных» анти-ВЛКРС антител в пробах достигали до 1:1024.

На следующем этапе наших исследований, пробы сывороток крови исследовали в ИФА до и после их инкубирования при 60°С в течение 1 часа. Всего исследовано 201 проба сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. 109 проб из Агрофирмы «Кама Агро», Рыбно-Слободского района и 92 проб из ООО «Серпы и Молот» Высокогорского района. Предварительно все пробы были анализированы в РИД. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты влияния температурного воздействия на титр свободных анти-ВЛКРС антител в ИФА

№ п/п	Хозяйства	Всего проб	РИД		ИФА без инкубации проб		ИФА с инкубацией проб
			Полож.	Отр.	Полож.	Отр.	Полож.	Отр.
1	Агрофирма «Кама Агро»	109	24	85	49	60	52	57
2	ООО « Серпы и Молот»	92	-	92	2	90	5	87

Таблица 2 - Изменение показателей оптической плотности (ОП) в ИФА, проб сыворотки крови до и после инкубирования.

№ п/п	Хозяйства	РИД	ИФА без инкубации проб		ИФА с инкубацией проб
			Result	ОП	Result	ОП
1.	ООО   «Агрофирма   им.	+	+	1,471	+	1,786
2.	В.П.Дементьева»	-	-	0,163	-	0,168
3.		+	+	1,493	+	1,550
4.	ООО «Ак Барс Дрожжан-	+	+	1,105	+	1,380
5.	ное»	-	-	0,159	-	0,198
6.		+	+	1,287	+	1,689
7.		-	-	0,173	-	0,173
8.		-	-	0,151	-	0,151
9.		-	-	0,126	-	0,144
10.		+	+	1,106	+	1,407
11.		-	+	0,800	+	1,105
12.		+	+	1,353	+	1,705
13.		-	-	0,420	+	0,781
14.		-	-	0,400	+	0,987
15.	А/Ф Актаныш	+	+	1,854	+	1,957
16.		-	-	0,152	+	0,733
17.		-	+	0,579	+	2,082
18.		-	-	0,097	+	0,647
19.		-	-	0,067	+	1,237
20.		-	+	0,597	+	2,077
21.		-	+	0,550	+	2,207
22.		-	+	0,753	+	2,082
23.		-	-	0,354	+	1,618
24.		-	+	0,602	+	1,937
25.		-	+	0,563	+	2,128
26.		-	-	0,400	+	1,987
27.	КФА «Низамов А.А»	+	+	0,954	+	0,981
28.		-	-	0,158	-	0,212
29.		-	-	0,122	-	0,127
30.		-	-	0,096	-	0,145
31.		-	+	0,943	+	0,965
32.		-	-	0,140	-	0,148
33.		-	-	0,094	-	0,169

По результатам исследования, количество положительных проб в ИФА до и после их инкубации по сравнению с РИД, значительно увеличилось. Из 85 отрицательно реагирующих в РИД проб полученных от агрофирмы Кама Агро», 28 реагировали положительно в ИФА (25 проб в ИФА без инкубации сывороток и еще 3 пробы в ИФА с инкубацией сывороток крови). Из 92 отрицательно реагирующих в РИД проб полученных от ООО «Серпы и Молот», 2 стали положительнными в ИФА до инкубации и дополнительно 3 реагировали положительно после инкубации при

60°С в течение 1-го часа.

В целях проверки достоверности полученных результатов были проведены исследования методом ИФА проб сывороток крови коров из 7-и разных хозяйств Дрожановского и Актанышского районов с учетом ОП лунок планшета.

Всего исследованы 33 пробы, с различной реакцией в РИД. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Из исследованного количества 8 проб сывороток крови были положительные и 25 были отрицательные в РИД. Из числа отрица- тельных в РИД проб, 8 реагировали положительно в ИФА до температурного воздействия и еще 7 после инкубирования при 60°С в течение 1 часа. Показатели ОП лунок в большинстве случаев увеличивались, однако следует отметить, что во многих пробах отрицательных в РИД и в ИФА, в целом оставались неизменными.

Показатели оптической плотности в результате температурного воздействия у некоторых проб увеличились на 1,5 пунктов и более.

Обсуждение результатов . Проведенные исследования доказывают, что ВЛКРС инфекция сопровождается образованием иммунных комплексов, в составе которых обнаруживаются «скрытые» противовирусные антитела.

Увеличение титров свободных антител после инкубирования объясняется диссоциацией иммунных комплексов, спецификой динамики образования антител и иммунных комплексов при лейкозе.

Исследования по обнаружению циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) при разных заболеваниях доказаны в работах многих исследователей [9,11,13].

Большинством исследователей отмечается, что определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) имеет большое значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу и может служить индикатором инфицированности животных вирусом [3,14].

Иммунные комплексы в сыворотке крови человека и животных могут формироваться из любых классов или подклассов иммуноглобулинов. По данным Ungar-Waron H. et al. (1992) и иммунные комплексы в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и IgG и IgM Соотношение антител в комплексах («связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни [2,7,10]. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркули-рующих иммунных комплексов. При этом титры свободных антител могут снижаться до минимальных значений [6]. Эти данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Разработанный способ диссоциации ЦИК при лейкозе и выявлять в ИФА «связанные» антитела без изменения их активности. Определение специфичных анти-тел в составе иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови не менее чем на 20%.

По результатам наших исследований, инкубирование сыворотки крови крупного рогатого скота при 60°С в течение 1 часа привело к увеличению титров свободных проти-волейкозных антител, что было доказано увеличением количества положи-тельных проб в ИФА. Увеличение титров свободных антител в исследуемых пробах и количества положительных проб после их инкубирования объясняется диссоцияции в них циркулирующих иммунных комплексов. Есть и положительные пробы, ОП которых оставались неизменными до и после диссоциации ЦИК (пробы №27,31). Данный факт означает, что титры «свободных» антител в крови животных были на пике, а ЦИК – на уровне минимальных значений.

Заключение. Определение специфических анти-ВЛКРС антител в составе иммунных комплесков позволяет увеличить достоверность выявления инфицированных и больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения антител в сыворотке крови. Термическая обработка проб сыворотки крови повышает чувствительность метода ИФА для выявления больных и инфицированных животных, что имеет важное значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу в разных хозяйствах.

Резюме

Настоящие исследования проводились в целях определения влияния термической обработки проб сывороток крови на чувствительности теста иммуноферментного анализа при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.