Тест-система для выявления антител к ВЛКРС методом дот-блот иммуноанализа

Последнее десятилетие стало периодом интенсивного развития и внедрения в широкую ветеринарную практику иммуноферментных тест-систем и наборов, предназначенных для иммунодиагностики инфекционных болезней животных. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования для проведения не только массовых, но и индивидуальных исследований. Дальнейшее развитие данной технологии направлено на расширение спектра анализируемых серологически значимых лигандов, а также на разработку экспресс тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять минимальные количества исследуемых иммунных комплексов без больших экономических затрат и за минимально короткий промежуток времени.

Наиболее перспективными в иммуноанализе являются экспресс тесты, разработанные на основе иммунохроматографии и модифицированные методы ИФА в дот-блот варианте (дот-иммуноанализ).

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможностей «антигена вируса лейкоза для ветеринарного применения» производства ФГУП «Курская биофабрика» в дот-иммуноанализе и в подборе условий иммобилизации антигена на нитроцеллюлозный носитель для изготовления экспериментальной партии диагностического теста по выявлению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС).

Материалы и методы . В работе использовались положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА, сыворотки крови крупного рогатого скота с неблагополучного по лейкозу хозяйства РТ; полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ); антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика»; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА.

Дот-иммуноанализ основан на иммунохимической реакции антиген -антитело. Исследуемые образцы биологических жидкостей наносят на твердый носитель в виде матрицы микроточек. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью антивидового конъюгата после добавления нерастворимого субстрата, образующего окрашенные пятна различной интенсивности в местах связывания антигена и антитела.

Результаты исследований и обсуждение . Методика постановки дот-блот иммуноанализа является общеизвестной и описывается, применительно для диагностики отдельных инфекций, в работах многих авторов (1, 2, 4). При разработке дот-блот тест-систем для выявления антител основной проблемой является качество применяемого антигена: специфичность, степень чистоты (отсутствия клеточного дебриса, дающего ложные результаты), гомогенность и химическая природа.

Антиген вируса лейкоза для ветеринарного применения производства ФГУП «Курская биофабрика» – лиофилизированная гомогенная аморфная масса светло-коричневого цвета с красноватым оттенком. При добавлении разбавителя полностью растворяется и представляет собой опалесцирующую жидкость темно-красного цвета (3)

Для постановки дот-иммуноанализа можно использовать различные твердофазные пористые носители. Носители на основе нитроцеллюлозы считаются наиболее удобными за счет высоких сорбционных свойств для белков (иммобилон) и простоты обращения с ними (4). На полосках нитроцеллюлозной мембраны шириною около 5мм отметили карандашом положение образцов в виде точек на расстоянии не менее 5мм друг от друга. Антиген ВЛКРС из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота использовали в двух вариантах. Во-первых, после подготовки согласно инструкции производителя и, во-вторых, после обработки специальными методами, направленными на повышение его чистоты и специфичности. Антиген наносили на НЦМ в объеме 10мкл, свободные после сорбции антигена места на мембране блокировали 0,1% раствором человеческого сывороточного альбумина с 0,05% детергентом твин-20, содержащим 50мМ триса (рН 7.2-7.3). Адсорбцию антигена проводили в течение 1-го, 2-х часов при +400С и в течение ночи при комнатной температуре. В качестве контрольных сывороток использовали положительные и отрицательные контроли коммерческого набора для выявления антител к ВЛКРС методом ИФА. Сыворотки наносили в объеме 10 мкл. Для визуализации образовавшихся иммунных комплексов в субстратном растворе использовали диаминобензидин (ДАБ). Учет результатов производили визуально по появлению или отсутствию коричневых пятен на точках нанесения образцов (рис.1).

Рис.1. Визуализация результатов дот-блот иммуноанализа.

По результатам исследований установили, что антиген ВЛКРС из набора для РИД исследований без дополнительной обработки не пригоден для дот-иммуноанализа. На полосках НЦМ проявлялись только едва заметные окрашенные пятна, по которым невозможно судить о характере иммунной реакции. Во втором варианте тест-системы, т.е. при использовании антигена после специальной обработки на НЦМ в точках нанесения положительной контрольной сыворотки развивались отчетливые окрашенные пятна, позволяющие визуально оценивать результаты реакции. Наибольшую чувствительность тест-системы отмечали при 2-х часовой адсорбции антигена.

Экспериментальную диагностическую тест-систему апробировали для выявления антител к ВЛКРС в пробах сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовали 12 проб. В качестве сравнительного теста использовали ИФА в классическом исполнении. 5 проб сыворотки крови - №№ 1, 3, 4, 6 и 9 были положительно реагирующими.

Результаты ИФА и дот-иммуноанализа в целом совпали, кроме пробы №4, которая в дот-блоте была отрицательной. Однако, нужно отметить, что и в ИФА данная проба сыворотки обладала низким коэффициентом специфичности – около 17, т.е. титры специфических антител не высокие.

Заключение. Проведенные исследования показали, что тест система для выявления антител к ВЛКРС по принципу дот-блот иммуноанализа вполне пригодна для скрининговых исследований на лейкоз крупного рогатого скота. Она обладает меньшей чувствительностью, чем ИФА, однако гораздо проще и дешевле при постановке, не требует специального оборудования. Одним набором можно исследовать до 100 до 500 проб (в зависимости от комплектации).

ЛИТЕРАТУРА: 1. Владыко А.С. Разработка и апробация диагностической тест-системы для выявления антител к ВИЧ методом дот-иммуноанализа/ А.С.Владыко, Т.В.Школина, Л.Е.Сурикова и др.//Рубрики:76.03.41, 76.35.33. Сроки выполнения НИР:1996-1998; 2. Аронова Н.В. Использование препаратов липополисахарида Fracisella Tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе/ Н.В.Аронова, Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина и др.// Ростов-на-Дону. Патент 2362170 от 20.07.2009; 3. Инструкция по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота; 4. Таранин А.В. Способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок/ А.В.Таранин, С.М.Мирошниченко, В.В.Перемыслов// Патент. № 2074393 от 27.02.1997;

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВЛКРС МЕТОДОМ ДОТ-БЛОТ ИММУНОАНАЛИЗА

Якупов Т.Р., Хаертынов К.С., Нурутдинова А.Г.

Резюме

Показана возможность использования дот-блот ИФА тест-системы, с применением антигена ВЛКРС для серологических реакций, для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

TEST SYSTEM FOR DETECTION OF FNTIBODIES TO BLV BY DOT-BLOT IMMUNOASSAY

Yakupov TR, Haertinov KS, Nurutdinova AG Summary

The possibility a dot-blots ELISA test systems for diagnostics of bovine leukemia is described.