Токсичность йессотоксина в эксперименте in vivo

Йессотоксин (YTX) является полиэфиром, состоящим из 11 смежных эфирных колец, ненасыщенной боковой цепи и двух эфиров сульфата. Известно более 90 производных йессотоксина. Впервые выделен в 1986 г. в Японии из гребешков Patinopecten yessoensis . YTX продуцируется водорослями – динофлагеллятами Protoceratium reticu-latum и Gonyaulax spinifera . YTX исключен из группы диарейных токсинов (окадаиковая кислота и ее аналоги – DSP-токсины), потому что, в отличие от окадаиковой кислоты, не вызывает диареи. Однако YTX и его аналоги часто экстрагируются вместе с диарейными токсинами и дают положительные результаты в биологических тестах, проводимых на наличие диарейного яда моллюсков [1].

Химическая структура YTX аналогична таковой структуре бреветоксинов и сигаутоксинов, которые оказывают действие на работу кальций-натриевого насоса и трансмембранных ионных каналов. Механизм, приводящий к активации фософодиэстеразы с помощью йессотоксина, включает начальное увеличение кальция в цитозоле клетки, доступного для каль-цийзависимой фосфодиэстеразы I типа, с последующим снижением внутриклеточной концентрации циклического аденозинмонофосфата [2, 3].

YTX способствует активности каспаз 3 и 7 в HeLa-клетках. Он снижает порог проницаемости митохондриальных мембран в печени крыс; вызывает нарушение цитоскелета культуры клеток нейронов мозжечка и далее их апоптоз; способствует нарушению межклеточной адгезии, что, в свою очередь, может стать одной из возможных причин развития болезни Альцгеймера [4–7]; влияет на иммунную систему, способствуя повышению количества цитокинов, за счет повышения экспрессии кодирующих их генов [8]. YTX индуцирует митотическую катастрофу и генетические изменения, которые могут представлять интерес для контроля прогрессирования опухолевого процесса [9].

Среднелетальная доза ЛД50 YTX и его аналогов в различных экспериментах, проведенных на мышах, составила от 100 до 500–750 мкг/кг [6]. На наш взгляд, разница значений токсичности для различных видов йессотоксинов зависит от особенностей их химической структуры. Безопасный уровень острого воздействия YTX (ARfD) составляет 25 μM/кг массы тела. Данные о токсичности YTX для других видов животных практически отсутствуют [3, 6, 10]. Постановлением Европейского союза № 853/2004 в 2004 г. был установлен регламент безопасного содержания йессотоксинов в моллю- сках – 1 мг/кг [11]. Вместе с тем результаты проводимых анализов содержания йессотоксинов в мясе моллюсков показали, что ни в одном из исследованных образцов содержание йессотоксинов не превысило 3,75 мг эквивалентов йессотоксинов/кг мяса моллюсков [6]. На этом основании был установлен новый максимально допустимый уровень содержания йессотоксинов в моллюсках – 3,75 мг/кг [12].

Таким образом, в настоящее время установлены показатели токсичности для YTX и некоторых его аналогов, определены основные молекулы-мишени его действия, его роль в качестве промотора апоптоза, выявлен максимально допустимый уровень йессо-токсинов в моллюсках. Однако, несмотря на растущее число данных о биологических эффектах, оказываемых YTX на теплокровный организм, точный механизм его действия до сих пор неизвестен.

Целью настоящей работы явилось исследование токсичности YTX в экспериментах in vivo в дозировках ниже установленного безопасного уровня острого воздействия.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на 72 крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 100 ± 10 г. Крысы получены из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Животные получали сухой сбалансированный корм производства фирмы ООО «Лабораторкорм» (Россия) в режиме неограниченного доступа. Крыс размещали по 2–3 особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещенности и температуре 21 ± 1 ° С. Все крысы были разделены методом случайной выборки на 12 групп численностью по 6 особей; исходная масса тела в группах не различалась ( p >0,1 ANOVA). Работу с животным проводили в соответствии с российскими требованиями к надлежащей лабораторной практике¹.

В работе использовали препарат YTX производства фирмы National Research Council Canada (Канада) в виде метанольного раствора (содержание YTX 4,3 ц моль). Непосредственно перед проведением исследований метанол удаляли из препарата методом вакуумного выпаривания при температуре не выше +20 ° С в течение не более 4 часов. Сухой остаток перерастворяли в 96 % растворе этилового спирта по ГОСТ 5962–2013². Для получения рабочих разведений токсина аликвоты спиртового раствора YTX разбавляли стерильным апирогенным раствором 0,15 М NaCl с получением растворов концентрацией 2 μM/кг (группы № 2, 6, 10), 8 μM/кг (группы № 3, 7, 11) и 12 μM/кг (группы № 4, 8, 12),

1 моль YTX = 1187,32 г. Все испытуемые дозы – ниже установленного значения безопасного уровня острого воздействия YTX (ARfD) – 25 μM/кг массы тела.

Растворы, содержащие YTX, вводили крысам указанных групп однократно в дозах 1 мл/кг массы тела внутрибрюшинно. Животным контрольных групп (№ 1, 5, 9) вводили в том же количестве физиологический раствор.

Выведение животных из эксперимента осуществляли через 6 (группы № 1–4), 24 (группы № 5–8) и 168 (группы № 9–12) часов после введения препаратов окадаиковой кислоты путем декапитации под эфирной анестезией. Собирали кровь с антикоагулянтом (трикалиевая соль ЭДТА), отбирали образцы ткани мозга для определения апоптоза и содержания малонового диальдегида, глутатиона в печени крыс. Массу внутренних органов (печень, почки, селезенка, легкие, сердце, тимус, надпочечники, гонады, мозг) определяли на электронных весах с погрешностью ± 0,01 г.

Биохимические показатели сыворотки выявляли на биохимическом анализаторе Konelab 20i (Финляндия). Уровень содержания малонового диальдегида в мозге определяли оптическим методом с 2-тиобарбитуровой кислотой и измерением уровня хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм [13]. Содержание восстановленного глутатиона в печени крыс определяли спектрофотометрическим методом согласно [14].

Гематологические показатели определяли в цельной крови стандартными методами на гематологическом анализаторе Coulter AC TTM 5 diff OV (Beckman Coulter, США) с набором реагентов (Beckman Coulter, Франция). Апоптоз клеток мозга изучали на проточном цитофлуориметре FC 500 (Beckman Coulter International S.A., Австрия) с использованием технологии окрашивания нейронов головного мозга в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннексином V и 7-аминоактиномици-ном (7-AAD) [15].

Статистическую обработку результатов проводили путем определения выборочного среднего, стандартной ошибки, вероятности принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок согласно критерию Стьюдента, Манна–Уитни и ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости р <0,05.

Результаты и их обсуждение. Введение YTX во всех указанных дозировках не вызвало признаков заболеваемости животных во всех опытных группах. Достоверного изменения массы тела животных, гонад, надпочечников, мозга не наблюдалось. Выявлено достоверное ( p <0,05) снижение массы селезенки, легких, тимуса (в % от массы тела) на протяжении всего времени проведения эксперимента. Наблюдалась тенденция к снижению массы сердца, почек и печени (рис. 1).

Определение гематологических показателей после введения YTX через 168 часов выявило снижение содержания лимфоцитов ( p <0,05) и тенденцию увеличения количества нейтрофилов в сыворотке крови подопытных животных. Выявлено, что введение токсина во всех испытываемых дозировках вызывало повышение содержания лейкоцитов на протяжении всего времени проведения эксперимента, что доказывается различием в полученных значениях для большинства экспериментальных групп с группой контроля ( р <0,05) (табл. 1).

Несмотря на то что изменения параметров состава крови не носили выраженного дозозависимого характера, полученные данные свидетельствуют о возможном негативном воздействии YET при его внутрибрюшинном введении в количествах, которые, согласно имеющимся сообщениям, не оказывают токсического воздействия на подопытных животных.

Уровень содержания мочевины в сыворотке крови при введении всех исследуемых доз снижался немонотонно, по сравнению с контрольными группами, на протяжении всего времени эксперимента. После 6 часов введения токсина наблюдалось повышение содержание креатинина, а после 168 часов – снижение этого показателя. Выявлена тенденция к снижению содержания общего белка во всех экспериментальных группах и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в плазме крови у крыс после 6 и 24 часов введения токсина. Полученные данные указывают на влияние YET на обмен белков, преобладание катаболических процессов в организме теплокровных животных, индуцируемых токсином (табл. 2).

Через 6 и 24 часа часов после введения YTX наблюдалась тенденция к снижению содержания триглицеридов и достоверное повышение холестерина в сыворотке крови (табл. 2). Такая динамика свидетельствует о влиянии YTX на обмен липидов и возможную индукцию воспалительного процесса под воздействием токсина, что подтверждает имеющиеся данные о механизме действия YTX [5, 6].

Впервые выявлено достоверное ( p <0,05) дозозависимое увеличение содержания малонового диальдегида (МДА) в ткани мозга через 168 часов после введения YTX (рис. 2) и тенденция к увеличению содержания восстановленного глутатиона в тканях печени (рис. 3). Кроме того, показано достоверное ( p <0,1) дозозависимое увеличение количества нейронов головного мозга с ранним аппоптозом (с 2,3 % при введении 2 µ М/кг до 3,02 % клеток при введении 12 µ М/кг; контроль – 1,78 % от общего количества клеток) и снижение активности позднего апоптоза (с 0,367 % при введении 2 µ М/кг до 0,180 % клеток при введении 12 µ М/кг; контроль – 0,45 % от общего количества клеток), фиксируемое в течение всего периода наблюдений за животными (рис. 4).

Полученные сведения дополняют имеющиеся данные литературы, свидетельствующие о том, что YTX является индуктором процессов катаболизма,

Рис. 1. Динамика изменения массы внутренних органов (в % от массы тела крыс). Ось абсцисс – доза и время введения YTX; ось ординат – вес органа в % от массы тела крыс. Число животных в каждой группе – 6: а – селезенка; б – сердце; в – легкие; г – почки; д – тимус; е – печень

Таблица 1

Гематологические показатели (эритроциты, лейкоциты), М ± m, крыс через 6, 24 и 148 ч после введения YTX (по 6 животных в каждой группе)

Группа	Доза YTX, мкг/кг ( µ М/кг)	Время после введения токсина, ч	Среднее содержание Hb в эритроците, пг	Средняя концентрация Hb в эритроците, г/л	Лейкоциты, 10 9 /л	Нейтрофилы, %	Лимфоциты, %	Моноциты, %
1	Контроль	6	20,2 ± 0,4	326,5 ± 1,3	8,9 ± 1,0	24,1 ± 2,3	61,8 ± 2,8	12,6 ± 1,6
2	2		20,4 ± 1,3	326,3 ± 1,8	14,0 ± 3,2	25,8 ± 3	63,7 ± 3,0	9,2 ± 0,8
3	8		21,0 ± 0,5	322,0 ± 3,4	10,0 ± 2,6	19,9 ± 2,8	65,8 ± 3,4	11,9 ± 0,6
4	12		19,5 ± 0,4*	321,6 ± 2,8	10,7 ± 1,5*	25,2 ± 1,8	62,6 ± 2,5	10,9 ± 0,8*
5	Контроль	24	19,7 ± 0,3	325,3 ± 2,4	11,2 ± 1,5	23,5 ± 3,0	60,8 ± 2,6	12,6 ± 1,3
6	2		20,7 ± 0,3	324,2 ± 3,6	13,9 ± 3,6*	26,8 ± 4,6	60,4 ± 6,1	11,7 ± 1,7
7	8		20,8 ± 0,7	323,8 ± 3,1	13,3 ± 2,7*	26,3 ± 4,6	61,6 ± 4,5	11,6 ± 0,7
8	12		20,3 ± 0,3	326,0 ± 3,7	10,5 ± 1,1	23,9 ± 3,0	62,6 ± 3,2	12,0 ± 1,3
9	Контроль	168	19,5 ± 0,2	330,5 ± 3,6	8,4 ± 0,8	27,2 ± 2,3	57,6 ± 2,3**	13,0 ± 1,9
10	2		19,7 ± 0,3	331,8 ± 2,0	10,3 ± 1,3*	35,6 ± 2,6*	50,7 ± 2,4**	11,9 ± 1,2
11	8		20,1 ± 0,3	328,8 ± 2,7	13,7 ± 1,9*	29,3 ± 4,7	59,2 ± 4,9**	10,0 ± 1,4
12	12		19,4 ± 0,3	329,8 ± 2,2	6,4 ± 0,8	29,4 ± 2,1	54,8 ± 1,0**	13,8 ± 1,9

П р и м е ч а н и е : * – различие с группой контроля для данного времени достоверно, p <0,05, Т -тест Стьюдента и/или критерий Манна–Уитни;

** – различие между группами (6 и 168 ч после введения YET) для данного критерия достоверно, p <0,05, Т- тест Стьюдента и/или критерий Манна–Уитни.

Таблица 2

Биохимические показатели плазмы крови крыс, М ± m , через 6, 24 и 168 ч после введения YTX (по 6 животных в каждой группе)

Группа	Доза YTX, мкг/кг ( µ М/кг)	Время после введения токсина, ч	Холестерин, ммоль/л	Триглицериды, ммоль/л	АЛТ, ед/мл	АСТ, ед/мл	Белок общ, г/л	Креатинин, мкмоль/л	Мочевина ммоль/л	Мочевая к-та, мкмоль/л
1	Контроль	6	1,29 ± 0,20	1,01 ± 0,21	103,26 ± 11,25	184,94 ± 19,49	62,59 ± 2,93	36,15 ± 0,85	9,93 ± 0,87	213,05 ± 13,48
2	2		2,29 ± 0,07*	1,08 ± 0,10	146,42 ± 14,96*	113,64 ± 41,35	58,58 ± 0,99	44,91 ± 1,24*	6,28 ± 0,16*	222,70 ± 21,37
3	8		2,22 ± 0,08*	0,87 ± 0,10	153,35 ± 15,92*	152,75 ± 59,19	56,87 ± 1,32*	43,20 ± 3,55*	5,66 ± 0,75*	243,48 ± 24,27
4	12		1,96 ± 0,25*	0,74 ± 0,11*	140,95 ± 7,39*	160,16 ± 42,13	59,54 ± 1,48	40,25 ± 0,75*	5,95 ± 0,49*	215,21 ± 29,85
5	Контроль	24	1,41 + 0,16	1,01 ± 0,25	101,29 ± 9,04	182,80 ± 36,41	62,25 ± 3,78	37,66 ± 0,95	10,10 ± 1,25	195,11 ± 27,61
6	2		2,08 ± 0,15*	0,76 ± 0,08*	137,97 ± 16,01*	300,23 ± 30,72	57,53 ± 1,20*	36,36 ± 0,60	5,82 ± 0,17*	108,47 ± 11,51
7	8		1,99 ± 0,11*	0,89 ± 0,08	104,11 ± 7,05	240,16 ± 36,03	54,97 ± 1,54*	37,76 ± 0,26	7,73 ± 0,30*	171,84 ± 22,86
8	12		2,00 ± 0,17*	0,81 ± 0,07	146,54 ± 19,2*	203,70 ± 44,27	58,91 ± 1,16	40,65 ± 1,44*	7,79 ± 0,31*	191,54 ± 35,40
9	Контроль	168	1,94 ± 0,19	0,79 ± 0,13	106,56 ± 12,33	280,39 ± 16,19	63,72 ± 3,92	42,35 ± 1,72	9,66 ± 0,51	183,68 ± 9,71
10	2		1,83 ± 0,09	0,71 ± 0,05	91,49 ± 8,58	206,67 ± 23,28	55,38 ± 0,97*	34,40 ± 1,39*	7,69 ± 0,59*	174,08 ± 27,71
11	8		2,30 ± 0,14*	0,82 ± 0,04	116,87 ± 14,46	187,33 ± 48,06	59,25 ± 3,04	35,32 ± 2,05*	7,26 ± 0,55*	167,79 ± 53,90
12	12		1,21 ± 0,04	1,24 ± 0,04	110,77 ± 8,21	86,57 ± 29,44	59,76 ± 1,79	36,76 ± 0,71*	9,81 ± 0,62	198,33 ± 24,56

П р и м е ч а н и е : * – различие с группой контроля для данного времени достоверно, p <0,05, Т -тест Стьюдента и/или критерий Манна–Уитни.

Рис. 4. Показатели апоптоза в ткани мозга (в % от общего количества нейронов в поле зрения) при введении YTX. Полученные значения количества клеток при «раннем» и «позднем» апоптозе достоверны и имеют разнонаправленный дозозависимый характер ( p <0,1)

Рис. 2. Содержание МДА в ткани мозга. Ось абсцисс – доза YTX; ось ординат – концентрация МДА в мозге, нмоль/г ткани. Число животных в каждой группе – 6

Рис. 3. Содержание восстановленного

глутатиона в печени крыс

выражающихся в активации свободнорадикального окисления и апотоза клеток головного мозга [3, 6, 10]. Впервые показано, что дозы YTX 2; 8 и 12 μM/кг могут оказывать токсическое воздействие на теплокровный организм.

Все испытуемые дозы ниже установленного значения безопасного уровня острого воздействия YTX ( ARfD = 25 μM/кг массы тела). Доза 2μM/кг соответствует допустимому уровню содержания токсина в моллюсках – 2,37 мг/кг. Полученные данные, а также данные, опубликованные в научной литературе о возможном токсическом действии YTX в дозах ниже ARfD , свидетельствуют о необоснованности увеличения максимально допустимого уровня содержания йессотоксинов в моллюсках с 1,0 до 3,75 мг/кг.

Выводы. Проведенные исследования показали наличие токсических эффектов йессотоксина при его внутрибрюшинном введении на протяжении всего времени проведения эксперимента при всех дозах – 2; 8 и 12 μM/кг. Все испытуемые дозы ниже установленного значения безопасного уровня

острого воздействия YTX (ARfD), равного 25 μM/кг массы тела. Данное действие проявлялось:

– в достоверном снижение массы селезенки, легких, тимуса (в % от массы тела) на протяжении всего времени проведения эксперимента, тенденции к снижению массы сердца, почек и печени;

– в усилении процессов катаболизма белков (снижение содержания белка, повышение количества креатинина, мочевой кислоты и АЛТ в плазме крови) и липидов (тенденция к снижению содержания триглицеридов и достоверное повышение холестерина в плазме крови) во всех экспериментальных группах;

– в усилении свободнорадикального окисления в головном мозге, выражающееся в дозозависимом росте показателей содержания малоново-

го диальдегида через 168 часов после введения токсина;

– в усилении процессов раннего апоптоза и снижении показателей позднего апоптоза в тканях головного мозга.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения дополнительных оценок рисков увеличения максимально допустимого уровня содержания йессотоксинов в моллюсках с 1,0 до 3,75 мг/кг.

Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках программы фундаментальных научных исследований (тема ФАНО России № 0529-2014-0044).