Токсикологическая оценка нового ранозаживляющего препарата «Маклозол»

161-170.

Введение. Актуальность проблемы лечения ран у домашних и сельскохозяйственных животных обусловлена их высокой распространенностью, частотой возникновения и полифакторнос-тью заболевания [1–3]. Арсенал ранозаживляющих средств в ветеринарии весьма ограничен, а их эффективность зачастую оказывается недостаточной для обеспечения полноценного восстановления тканей и предотвращения осложнений [4]. Во многом это связано с многообразием типов ран, спецификой этиопатогенеза и факторов, влияющих на процесс заживления, включая инфекционные агенты, механические повреждения, трофические нарушения и иммунные реакции организма. В связи с этим возникает необходимость поиска и внедрения новых препаратов комбинированного состава, способных эффективно воздействовать на различные аспекты раневого процесса [1, 5, 6]. Ввиду того, что раны бывают различного типа и различной степени тяжести, препараты для их лечения могут использоваться на протяжении продолжительного периода, особенно в случае осложненных ран, хронических или повторяющихся травм. В этой связи одним из ключевых направлений в разработке новых ранозаживляющих средств является конструирование препаратов, обладающих не только высокой специфической активностью, но и безопасностью применения. Поэтому вновь разработанные потенциальные препараты проходят тщательную оценку на всех этапах доклинического исследования, включая оценку общетоксических свойств [7]. Особое внимание при этом уделяется оценке острой и хронической (субхронической) токсичности новых фармакологических средств. Оценка острой токсичности позволяет оценить потенциальные риски, определить возможные негативные эффекты, связанные с краткосрочным использованием препарата. Хроническая (субхроническая) токсичность, в свою очередь, оценивается при длительном (от нескольких дней до нескольких месяцев) применении препарата и помогает выявить потенциальные кумулятивные эффекты, которые могут проявляться в виде нарушений функций различных органов и систем [8, 9]. Эти исследования критически важны для определения безопасных временных рамок и дозировок применения нового препарата и могут быть использованы как ключевые этапы исследования безопасности его применения.

В отделе фармакологии ФГБНУ КНЦЗВ был разработан новый ранозаживляющий препарат «Маклозол» комбинированного состава с поли-функциональными свойствами для ветеринарного применения. «Маклозол» представляет собой полупрозрачный гидрофильный однородный гель светло-коричневого цвета без видимых механических включений [10, 11]. Входящие в его состав активные компоненты природного и синтетического происхождения обладают выраженными лечебными свойствами – антибактериальными, антиэкссудативными, репаративными и регенерирующими. В рамках доклинического исследования «Маклозола» представлялось необходимым провести оценку его острой и субхронической токсичности.

Цель исследования – оценить острую и субхроническую токсичности ранозаживляющего геля «Маклозол» на лабораторных животных. Исследование нацелено на установление безопасных дозировок применения препарата, анализ клинических признаков токсичности и выявление потенциальных негативных эффектов, связанных с длительным использованием препарата «Маклозол».

Объекты и методы. Исследования проводились с соблюдением российских стандартов, касающихся проведения научных экспериментов на лабораторных животных («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под общей редакцией Р.У. Хабриева (2005); «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (часть первая) под редакцией А.Н. Миронова (2012); правила проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения (Приказ Минсельхоза РФ от 6 марта 2018 г. № 101 «Об утверждении Правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственно- го препарата для ветеринарного применения»); ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности»; «Научно-методические аспекты исследования токсических свойств фармакологических лекарственных средств для животных» А.М. Смирнова, В.И. Дорожкина (2008)).

Для изучения острой токсичности ранозаживляющего геля «Маклозол» были отобраны лабораторные крысы (n = 20) массой тела от 220 до 235 г по 10 лабораторных животных в опытную и контрольную группы. Выбранная для эксперимента возможная токсическая доза геля «Маклозол» составила 6000 мг/кг массы тела, при этом количество геля для каждого животного рассчитывалась индивидуально. Опытной группе животных вводили исследуемый препарат – ранозаживляющий гель «Маклозол». Для этого из геля готовилась 20–30 % водная суспензия, которая однократно вводилась крысам с использованием одноразового трехкомпонентного шприца через атравматичный зонд в объеме 5 мл на каждую особь. Сравнение проводилось с данными, полученными в ходе наблюдения за лабораторными животными контрольной группы, которым вводилась гелевая основа (плацебо), растворенная в аналогичной пропорции в дистиллированной воде, в количестве 5 мл однократно. Мониторинг состояния животных по возможным клиническим признакам токсичности (активность, диарея или другие нарушений со стороны ЖКТ, состояние кожи и шерсти) отмечали в течение 14 дней (ежедневно), с контрольными точками в 1-, 7- и 14-й день. При проведении эксперимента параметры состояния животных изучали в день эксперимента через каждый час от момента введения препарата; в течение последующих 3 дней – три раза в сутки; в оставшиеся дни до 14-го дня – один раз в сутки.

Эксперимент по оценке субхронической токсичности включал длительное воздействие ранозаживляющего геля «Маклозол» на лабораторных животных. Лабораторные нелинейные крысы (n = 40) со массой тела от 145 до 156 г были разделены на четыре группы: 1-я опытная группа получала 1/10 от LD50 или, при отсутствии падежа, от максимально-испытанной дозы в эксперименте по определению острой токсичности, 2-я опытная группа – 1/20, 3-я опытная группа – 1/50, а 4-я, контрольная, группа полу- чала плацебо в эквиобъемной дозе. Количество лабораторных животных – по 10 лабораторных крыс в каждой группе. Ежедневно, в течение 30 дней животные опытных групп (1, 2 и 3) натощак получали злаковые болюсы с определенными дозами исследуемого средства, а животные контрольной группы получали злаковые болюсы с гелевой основой (плацебо). Аналогично изучению острой токсичности, мониторинг состояния животных по клиническим признакам отмечали в течение 30 дней ежедневно, с контрольными точками на 1-, 10-, 20- и 30-й дни.

Учитывая тот факт, что введение средства в дозе 6000 мг/кг массы тела в рамках острого эксперимента не вызвало падежа животных (LD50 не установлена) и в результате данная доза явилась максимальной и единственной, то субтоксические дозы геля «Маклозол» для субхронического эксперимента рассчитывались исходя из данной дозы и составили: 1-я опытная группа (n = 10) 1/10 – 600 мг/кг массы тела; 2-я опытная группа (n = 10) 1/20 – 300 мг/кг массы тела; 3-я опытная группа (n = 10) 1/50 – 120 мг/кг массы тела; контрольная группа (n = 10) – 600 мг/кг (гелевая основа).

Средства для оценки токсичности включали стандартные методы и оборудование для измерения физиологических параметров. В каждом эксперименте (острая и субхроническая токсичность) регулярно оценивались масса тела (измерялась с точностью до 0,1 г); активность (оценка уровня активности по шкале, где 0 – отсутствие активности, 3 – высокая активность); наличие диареи или других нарушений со стороны ЖКТ; состояние кожи и шерсти (проверка на наличие покраснений, выпадения шерсти). Показатели крови (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, СОЭ, общий белок, АсАТ, АлАТ, щелочная фосфатаза, глюкоза, мочевина, креатинин, холестерин, кальций, фосфор, билирубин) определялись в рамках субхронического эксперимента. Для этого в последний день клинической части эксперимента у 5 крыс из каждой группы была взята кровь для биохимического анализа (анализатор биохимический Vitalab Flexor Junior с версией программного обеспечения 1.0. (открытая система для проведения фотометрических тестов, изготовитель Vital Scientific N. V. Netherlands. Статистическая обработка количественных результатов проводилась с ис- пользованием программного обеспечения фирмы Miсrosoft.

Результаты и их обсуждение. Перед началом экспериментов по оценке уровней токсичности в остром и субхроническом эксперименте все животные были помещены в карантин для выявления возможных отклонений от нормальных физиологических параметров, обнаружения скрытых патологий, а также для мониторинга развития патологии. Температура в помещениях вивария варьировала от 20 до 22 °С при относительной влажности 40–60 %. Освещение поддерживалось в режиме день/ночь с двенадцатичасовым периодом освещения лампами дневного света с этапами плавного затухания (1 ч) и двенадцатью часами темноты, что позволило создать комфортную обстановку для поддержания естественных биоритмов животных и снизить стресс. Лабораторные животные находились в стандартных клетках. В качестве подстилки использовались древесные опилки. Животные получали сбалансированное питание, включающее качественные кормовые смеси с необходимыми витаминами и минеральными веществами. В рацион были включены свежие овощи и фрукты, постоянный доступ к чистой и свежей воде. Соблюдение данных условий создало оптимальную среду для пребывания лабораторных крыс в карантине, что обеспечило достоверность результатов токсикологических испытаний.

Для принудительного перорального введения препарата «Маклозол» лабораторным крысам готовили суспензию геля индивидуально, исходя из массы тела каждого животного (эквивалентно 6000 мг/кг), посредством диспергирования в дистиллированной воде до достижения объема 5,0 мл. Затем подготовленный препарат в объеме 5 мл однократно вводился крысам натощак после 12 ч голодной диеты с помощью зонда и шприца непосредственно в желудок (рис. 1, 2). Ежедневно проводился регулярный осмотр лабораторных животных на наличие признаков заболеваний или стресса, фиксировались все отклонения в поведении животных и отклонения физиологических показателей от нормальных значений. Результаты испытаний на острую токсичность представлены в таблице 1.

Рис. 2. Процесс введения образца лабораторным крысам при определении острой токсичности геля «Маклозол» The process of introducing a sample to laboratory rats in determining the acute toxicity of the Maklozol gel

Рис. 1. Зонд и шприц, наполненный суспензией геля «Маклозол»

Probe and syringe filled with a suspension of «Maklozol» gel

Таблица 1

Влияние однократного введения суспензии геля «Маклозол» и гелевой основы на физиологические параметры состояния животных в остром эксперименте (M ± m; n = 10)

The effect of a single injection of a suspension of «Maklozol» gel and a gel base on the physiological parameters of the animal condition in an acute experiment (M ± m; n = 10)

Параметр	1-е сутки		7-е сутки		14-е сутки
	Опытная группа	Контрольная группа	Опытная группа	Контрольная группа	Опытная группа	Контрольная группа
Масса тела, г	227,5±5,6	230,1±3,9	229,3±4,1	231,8±4,5	232,9±5,0	233,5±3,5
Активность	±	±	+	+	+	+
Аппетит	±	±	+	+	+	+
Наличие диареи и/или нарушений со стороны ЖКТ	–	–	–	–	–	–
Состояние кожи и шерсти	+	+	+	+	+	+

В ходе проведенных испытаний, направленных на оценку острого токсического воздействия геля «Маклозол», были получены качественные и количественные данные, анализ которых позволил сделать объективный вывод о токсикологической безопасности исследуемого препарата. В течение 30 мин после введения образцов как в опытной, так и контрольной группе крыс наблюдалось незначительное ухудшение состояния животных, проявляющееся в снижении моторных функций, несколько замедленной реакции на внешние раздражители и общем угнетениии. Это явление было связано с проведением манипуляций и принудительным введением значительного объема геля. Восстановление нормального состояния происходило постепенно, в течение 30–60 мин постоянного наблюдения за опытными объектами. Масса тела лабораторных животных осталась стабильной и не показала значительных достоверных изменений по сравнению с контрольной группой. Оценка уровня активности в последующие дни показала, что все животные демонстрировали стабильную высокую активность на протяжении всего эксперимента. Используемая шкала оценки показала, что большинство животных находились в диапазоне 2–3, что свидетельствует о хорошем самочувствии и отсутствии негативного воздействия на поведение. Наблюдения за состоянием желудочно-кишечного тракта не выявили ни одного случая диареи или других нарушений. Животные сохраняли аппетит и нормальную пищеварительную функцию, что также указывает на отсутствие токсического воздействия геля «Маклозол». Мониторинг состояния кожи и шерсти не выявил никаких отклонений. Все испытуемые животные имели здоровую кожу и шерсть без покраснений или выпадения, летальность отсутствовала, что является прямым подтверждением безопасности препарата.

Таким образом, в ходе исследования абсолютная летальная (LD100) и средняя летальная доза (LD50) для геля «Маклозол» не были выявлены, поскольку однократное введение в желудок грызунов препарата в дозе 6000 мг/кг массы тела не привело к проявлениям токсикоза или гибели животных. Увеличение дозировок представлялось нецелесообразным, так как выбранная доза превышала верхнюю границу 4-го класса опасности в соответствии с используемым ГОСТ, и технически было неосуществимо из-за повышения вязкости задаваемого препарата ввиду возрастания концентрации гелеобразующих веществ. Из этого следует, что гель «Маклозол» классифицируется как малотоксичный и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).

Для проведения субхронического эксперимента ежедневно крысам 1–3 опытных групп проводилась подача злаковых болюсов с исследуемым средством в установленных дозах, а животные контрольной группы получали болюсы с гелевой основой. Осуществлялся визуальный контроль поедаемости. Каждый день проводился осмотр лабораторных животных на наличие признаков заболеваний или стресса, отмечались все изменения в физиологических показателях. Результаты исследования субхронической токсичности геля «Маклозол» зафиксированы в таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Влияние длительного применения геля «Маклозол» и гелевой основы на прирост массы тела лабораторных крыс (M ± m; n = 5)

The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel base on body weight gain in laboratory rats (M ± m; n = 5)

Группа	Масса тела (г)				Прирост массы тела на 30-е сутки, %
	1-е сутки	10-е сутки	20-е сутки	30-е сутки
1-я опытная	147,9±3,59	152,1±3,48	156,0±2,99	160,3±2,83	8,4
2-я опытная	149,5±2,55	153,9±2,79	157,1±2,85	162,3±2,40	8,6
3-я опытная	151,7±3,64	155,3±3,51	159,9±4,11	165,1±3,81	8,8
Контрольная	148,0±2,81	153,2±2,75	157,7±3,63	161,2±2,71	8,9

Подопытные животные потребляли физиологически нормальное количество корма и воды и на протяжении всего месяца при взвешивании 1 раз в десять дней не имели статистически значимых отличий от контрольных крыс по динамике массы тела. Так, по результатам суб- хронической токсичности в экспериментальных группах 1, 2 и 3 среднегрупповой прирост массы тела за период эксперимента был ниже значений контроля всего на 0,5, 0,3 и 0,1 % соответственно.

Таблица 3

Влияние длительного применения геля «Маклозол» и гелевой основы на физиологические параметры состояния животных в субхроническом эксперименте (n = 10) The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel base on the physiological parameters of animals in a subchronic experiment (n = 10)

Параметр

1-е сутки

10-е сутки

20-е сутки

30-е сутки

1

2

3

К

1

2

3

К

1

2

3

К

1

2

3

К

Активность

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Аппетит

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Наличие диареи и/или нарушений со стороны ЖКТ

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Состояние кожи и шерсти

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

В группах, получавших препарат «Маклозол» в форме геля, у 100 % животных не отмечались изменения в поведении (сохраняли адекватную координацию движений и соответствующие реакции на внешние воздействия), потеря аппетита после дачи болюсов не фиксировалась. Так, в течение всего периода клинической части эксперимента у крыс не наблюдалось даже кратковременных изменений в активности и поведенческих реакциях. Не зарегистрированы отклонения функции пищеварительной системы, а также нарушения состояния кожи и шерстного покрова. Контрольная группа, получавшая плацебо, не имела значительных различий с опытными группами ни по одному из оцениваемых критериев. Применение геля «Маклозол» не привело к гибели животных в течение всего периода эксперимента и в течение 10 сут после его завершения.

У пяти случайным образом отобранных из каждой группы животных на 30-е сут опыта исследовалась кровь. В таблице 4 приведены данные лабораторного исследования крови крыс, получавших различные дозы препарата, а также значения аналогичных маркеров для крыс контрольной группы, в контексте основных гематологических и биохимических параметров.

Таблица 4

Влияние продолжительного использования геля «Маклозол» и гелевой основы на показатели крови лабораторных крыс в период проведения субхронического токсикологического эксперимента (M ± m; n = 5)

The effect of prolonged use of «Maklozol» gel and gel base on rat blood parameters (M ± m; n = 5)

Показатель (норма)	Группа, препарат
	1-я опытная: «Маклозол», 600 мг/кг	2-я опытная: «Маклозол», 300 мг/кг	3-я опытная: «Маклозол», 120 мг/кг	Контроль: гелевая основа, 600 мг/кг
1	2	3	4	5
Эритроциты,1012/л	7,9±0,65	8,1±0,54	8,0±0,36	8,2±0,47
Лейкоцты,109/л	9,5±0,21	9,7±0,19	9,4±0,24	9,9±0,25
Гемоглобин, г/л	141,3±6,72	148,1±5,23	143,5±8,56	149,4±7,35
СОЭ по Панченкову, мм/ч	1,7±0,17	1,9±0,25	1,6±0,11	1,7±0,23
Общий белок, г/л	81,2±1,24*	80,9±0,73	75,8±1,36	76,7±2,19
АсАТ, ЕД/л	66,3±1,41	63,5±2,31	61,4±2,11	62,8±1,65
АлАТ, ЕД/л	31,7±0,76	30,1±1,65	28,4±1,07	31,4±0,75
Щелочная фосфатаза, ЕД/л	754,2±36,80	695,37±54,41**	729,7±28,93*	774,6±38,29
Глюкоза, мМ/л	7,5±0,63	8,0±0,72	8,1±0,55	7,8±0,74
Мочевина, мМ/л	6,1±0,11	6,2±0,14	6,3±0,25	5,8±0,10

Окончание табл. 4

1	2	3	4	5
Креатинин, мкМ/л	39,8±0,71	41,7±0,66	40,1±0,98	42,2±0,74
Холестерин, мМ/л	1,7±0,05	1,8±0,07	1,6±0,08	1,8±0,04
Кальций общий, мМ/л	2,41±0,09	2,47±0,13	2,40±0,15	2,46±0,11
Фосфор неорганич., мМ/л	2,20±0,12	2,28±0,17	2,24±0,17	2,23±0,19
Билирубин общий, мкМ/л	8,8±0,54	9,1±0,32	8,5±0,47	8,7±0,41

Примечание . Степень достоверности к контролю: *р ≤ 0,05; **р ≤ 0,01.

Биохимические анализы крови в конце эксперимента не показали значительных отклонений по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует о безопасности препарата при длительном применении. Эритроциты и лейкоциты находились в норме во всех группах, показывая стабильное состояние здоровья (различия между группами несущественны). Гемоглобин у животных опытных групп ниже (максимальная разница в 1-й опытной группе – 5,7 %), чем у контрольной группы, но находится в пределах видовой нормы (от 141,3 до 148,1 г/л), что указывает на отсутствие анемии. СОЭ низкая, что свидетельствует об отсутствии воспалительных процессов. Показатели общего белка в опытных группах варьируют от 75,8 до 81,2 г/л, выше в 1-й и 2-й опытных группах (на 5,9 и 5,5 % соответственно выше контроля), что может указывать на активизацию белкового обмена в данных группах. В уровне трансаминаз (АлАТ и АсАТ) не зафиксированы значимые различия с контрольной группой. Показатели глюкозы, холестерина, мочевины и креатинина находятся в норме, что подтверждает отсутствия нарушений в обмене веществ и функции почек. Уровень щелочной фосфатазы соответствует возрасту крыс и ниже в опытных группах. Значения таких жизненно важных макроэлементов, как кальций и фосфор, во всех группах соответствуют видовой и возрастной норме и не имеют существенных различий между опытными и контрольными группами. Нарушений в пигментном обмене, выраженном в определении уровня общего билирубина, не установлено ни в одной группе. Диагностически значимых изменений в количестве лейкоцитов в крови крыс опытной и контрольной групп не установлено.

Заключение. По результатам определения токсичности нового ранозаживляющего геля «Маклозол» в остром и субхроническом эксперименте было выявлено, что препарат не проявляет системного токсического действия на организм лабораторных крыс и не оказывает отрицательного влияния на основные функциональные системы организма при длительном применении в субтоксических дозах. Гель «Маклозол» был классифицирован как малотоксичный и отнесен к 4-му классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности»).