Токсиколого-гигиеническая оценка аллергенной активности и опасности сухих дрожжевых грибов

Наиболее эффективной мерой профилактики профессиональной и производственно-обусловленной патологии у работников является разработка предельно допустимой концентрации (ПДК) и методов контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны. С этих позиций обращает на себя внимание отсутствие гигиенических нормативов содержания в воздухе рабочей зоны целого ряда производимых и используемых микроорганизмов-продуцентов и биопрепаратов.

К таким приоритетным промышленным штаммам микроорганизмов относятся, прежде всего, хлебопекарные, винные и спиртовые дрожжевые грибы Saccharomyces cerevisiae . Их очень широко используют в натуральном и сухом виде для производства продуктов питания, спирта и виноматериалов, с ними контактирует в процессе применения и производства большой контингент работников. У людей, работающих в условиях профессионального воздействия аэрозолей нативных дрожжевых грибов штамма Saccharomyces cerevisiae Л153 и сухих хлебопекарных дрожжей, установлена высокая распространенность нарушений здоровья, преимущественно аллергического и иммунопатологического характера. Наблюдаются выраженные сдвиги и дисбаланс гуморальных и клеточных показателей системы иммунитета, формирование в организме механизмов аллергических реакций профессиональной этиологии [1, 2].

К настоящему времени экспериментально обоснована и утверждена в Республике Беларусь величина ПДК в воздухе рабочей зоны (далее – ПДК врз ) дрожжевых клеток штамма Saccharo-myces cerevisiae Л153 на уровне 1000 м.кл./м³, III класс опасности с отметкой «аллерген», а также разработана аттестованная методика выполнения измерений их концентраций в воздухе рабочей зоны [3].

Последующей поставлена актуальная задача обосновать ПДКврз сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжей (далее – СХД, СВД и ССД). Причем загрязняющие воздух рабочей зоны сухие дрожжевые грибы относятся к органическим белоксодержащим аэрозолям, и методические подходы к их гигиеническому нормированию отличаются от таковых при регламентировании жизнеспособных промышленных штаммов микроорганизмов. Непременным этапом экспериментального обоснования ПДКврз сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжей является определение степени их сенсибилизирующей способности и аллергенной опасности.

Цель исследования – экспериментальное установление степени сенсибилизирующей способности и аллергенной опасности сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжевых грибов.

Материалы и методы. Объектом экспериментальных исследований являлись СХД, СВД и ССД, произведенные на основе биомассы производственных штаммов дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae . Образцы для исследований предоставлены ОАО «Дрожжевой комбинат» г. Минска.

Использованы отдельные приемы и методические подходы к изучению биологического действия и регламентированию в воздухе рабочей зоны органических аэрозолей по белку, разработанных и апробированных при нормировании ряда органических пылей животного, растительного и смешанного происхождения [4].

Для реализации цели работы необходимо было, прежде всего, решить две задачи. Во-первых, для экспериментального моделирования воздействия на организм практически нерастворимых в воде сухих дрожжевых клеток и выявления их биологического действия, необходимо было получить из них растворимые белково-антигенные субстанции. Проблема решения данной задачи заключалась в высокой устойчивости и прочности клеточной стенки дрожжевых грибов, в структуру которой входит хитин.

На основании подбора и апробации различных способов гидролиза хитина и других структур дрожжевых клеток установлены оптимальные условия и разработана оригинальная методика получения из сухих дрожжевых грибов экстракт-аллергенов с максимально возможным содержанием растворимых субстанций по белку.

Методы экспериментального моделирования и выявления сенсибилизации достаточно добротно разработаны и широко используются для изучения и гигиенического нормирования производственных органических аэрозолей как облигатных аллергенов, но только в опытах на наиболее чувствительных по иммунологической реактивности морских свинках-альбиносах [4]. Однако приобретение в настоящее время морских свинок-альбиносов не только весьма затратно ввиду их высокой стоимости, но и недоступно в результате отсутствия в Белару- си питомника этих лабораторных животных. Поэтому для установления сенсибилизирующей способности сухих дрожжей по их растворимым белково-антигенным субстанциям, выделенным в экстрактах, необходимо решение второй задачи – подобрать и апробировать доступные и объективные методы экспериментального моделирования сенсибилизации и выявления специфического гипериммунного ответа организма замедленного типа на облигатный аллерген, а также определить критерии оценки степени аллергенной активности и классифицирования аллергенной опасности антигенных субстанций сухих дрожжевых клеток.

Модифицированной нами альтернативной методикой (описывается далее) в краткосрочных экспериментах на белых мышах определялась степень сенсибилизирующей способности растворимых полисахаридо-белковых субстанций сухих дрожжевых клеток и класс их аллергенной опасности. Для эксперимента формировали пять групп белых мышей по 12 особей в каждой, рандомизированных по массе (самцы, масса 24–27 г).

Для сенсибилизации животных и тестирования использовали полученные экстракты из образцов СХД, СВД и ССД. Приготавливали сенсибилизирующие смеси: в соотношении 1:1 полный адъювант Фрейнда (Sigma, далее – ПАФ) и соответствующий экстракт, исходя из количества в стандартной дозе на одно животное 0,03 см3 ПАФ и 0,03 см3 экстракта с содержанием 300 мкг белка.

Условия содержания, обращения, проведения экспериментов и выведения лабораторных животных из опыта соответствовали требованиям технических нормативных правовых актов и основывались на международных принципах биоэтики.

Результаты исследования подвергались статистической обработке общепринятыми методами с использованием пакета статистической программы Statistica 10.

Результаты и их обсуждение. Для экспериментального моделирования воздействия на организм практически нерастворимых в воде сухих дрожжевых клеток и выявления их биологического действия, прежде всего аллергического и иммунотоксического, необходимо было получить из них экстракт с максимально возможным содержанием растворимых белоксо-держащие субстанций.

Из данных литературы известно более 16 способов выделения антигенов из дрожже- вых и дрожжеподобных грибов [5]. На основе результатов испытаний различных способов экстрагирования ранее был использован метод, основанный на инактивации и частичном разрушении мембран дрожжевых клеток четырехкратным замораживанием (при –22 °С) и быстрым оттаиванием, воздействии ультразвуком, четырехсуточном экстрагировании в щелочной водно-солевой раствор Соса на холоде из биомассы и выделении растворимых полисахаридно-белковых антигенных комплексов. Полученный экстракт из СХД был высокоаллергоспецифичным и антигенно обособленным, но содержал только 3 мг/см3 белка (50000 ед. PNU), что было достаточно для эффективного использования в лабораторных методиках аллергодиагностики в качестве тест-аллергена [6], но крайне мало для экспериментального моделирования.

Был апробирован известный способ получения аллергенов из кокковых бактериальных клеток В.Ф. Руновой [6, 7]. Метод основан на экстрагировании белоксодержащих субстанций из сухой массы бактериальных клеток 1 % раствором гидроксида калия в течение суток при комнатной температуре, их осаждении 50 % раствором уксусной кислоты и последующем растворении белкового преципитата в слабощелочной среде. Способ оказался эффективным для получения диагностических экстрактов-аллергенов из промышленных штаммов бактерий Bacillus subtilis и Pseudomonas fluo-rescens с доказанной их высокой специфичностью, антигенной обособленностью и антигенной чистотой. Но он также малопродуктивен для получения экстракта из дрожжевых грибов.

Высокую устойчивость и жесткость клеточной стенки дрожжевых грибов определяет входящий в их структуру хитин, который является природным полимером из остатков N-ацетилглюкозамина, связанных между собой β-(1-40)-глюкозидными связями, ассоциированным с белками. Поэтому для получения из сухих дрожжевых клеток экстракта основывались на принципе кислотного гидролиза глюкозидных связей природных полимеров, использованного, например, В.В. Соколовским и соавт. [8] для определения концентраций БВК в окружающей среде по белку. Для гидролиза поверхностных β-глюкозидных связей между элементарными звеньями азотсодержащего полисахарида клеточной стенки грибов подготовленные образцы сухих дрожжей предварительно подвергали кратковременному воздействию (5 мин) 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты при нагревании. Затем после быстрого охлаждения в течение двух часов проводили экстрагирование клеточной суспензии в щелочной среде (рН 8–8,4) внесением 2Н водного раствора гидроксида натрия с последующим отделением осадка центрифугированием. Для осаждения в полученном супернатанте белоксодержащих субстанций использовали охлажденную соляную кислоту и центрифугирование, а растворение преципитата проводили в физиологическом растворе с постепенным доведением рН до 7,2–7,4 1Н водным раствором гидроксида натрия. Содержание в экстрактах белоксодер-жащих субстанций определяли методом Лоури.

С использованием разработанной методики получены экстракты из СХД, СВД и ССД (далее – ЭСХД, ЭСВД и ЭССД) с высоким содержанием растворимых полисахаридно-белковых субстанций (в концентрациях более 30,0 мг/см³ по белку), что достаточно для экспериментального моделирования воздействия на организм и выявления особенностей их биологического действия. Экстракты сохраняли при -18 ° С без добавления консервантов.

Принципы экспериментальной оценки степени выраженности сенсибилизирующей способности и класса аллергенной опасности промышленных веществ химической и биологической природы достаточно разработаны [9]. Они основаны на объективных количественных критериях учета количества опытных животных с установленной гиперчувствительностью замедленного типа (ГЗТ) по результатам положительной кожной или внутрикожной провокационной пробы. Важным является уровень значимости различий средних величин выраженности интегральных показателей кожных реакций в баллах на провокационную пробу в опытной и контрольной группах животных по критериям t Стьюдента или U Манна–Уитни, а также по «жесткому» критерию Х Ван Дер Вардена. Но унифицированные методы сенсибилизации и выявления ГЗТ, выполняемые в основном в экспериментах на морских свинках-альбиносах, длительны, затратны и не всегда доступны.

С этих позиций привлекательна альтернативная методика изучения и оценки сенсибилизирующей способности химических веществ на белых мышах. Согласно этой методике для сенсибилизации белых мышей используют смесь испытуемого вещества с ПАФ в строго определенной дозе, а выявляют ГЗТ на шестые сутки опыта кожным (на ухо) или внутрикожными (в ухо или заднюю лапу) провокационным тес- том [10, 11]. Метод воспроизведения сенсибилизации на мышах с применением ПАФ, основывается на том, что ГЗТ хорошо воспроизводится на мышах, а введение ПАФ с изучаемым веществом усиливает индукцию ГЗТ вследствие угнетения формирования субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов-супрессоров. Процесс сопровождается усилением аллергических реакций, что позволяет выявить аллергенные свойства даже слабых химических аллергенов [11].

На белоксодержащие вещества как полные антигены в организме формируется гипериммунный процесс со смешанными механизмами аллергической реакции, но с превалированием механизма немедленного анафилактического типа, реализуемого антителами – специфическим иммуноглобулином IgE – за счет преимущественной активации хелперной регуляции иммунного ответа 2-го типа. В то же время использование для сенсибилизации изучаемого гетероантигена в смеси с ПАФ, содержащей антигены туберкулезных бацилл и вводимой в организм внутрикожно (создание «депо»), стимулирует переключение хелперной регуляции иммунного ответа 2-го типа (Th2) на 1-й тип с развитием преимущественно клеточно-опосредованных механизмов гиперчувствительности замедленного типа [11, 12].

Вышеизложенное явилось обоснованием разработки адаптированной методики определения степени аллергенной активности и класса аллергенной опасности веществ биологической природы по их растворимым белково-антигенным субстанциям в экспериментах на белых мышах. Суть методики при изучении дрожжевых грибов заключалась в следующем: животным каждой опытной группы смесь с конкретным экстрактом вводили строго внутрикожно в основание хвоста по 0,06 см3, контрольным животным аналогично вводили смесь ПАФ и физиологический раствор. На шестые сутки эксперимента белым мышам опытных и контрольных групп после измерения электронным микрометром исходной толщины задней лапы вводили в подушечку (под апоневроз) каждой конкретной лапы прямые или перекрестные провокационные дозы соответствующих экстрактов (400 мкг белка) в объеме по 0,04 см3. На следующие сутки (через 24 ч) повторно измеряли толщину тех же лап, рассчитывали абсолютную величину отека лап в миллиметрах по разнице в толщине лап белых мышей до и после внутрикожного тестирования, переводили полученные абсолютные значения внутри- кожного теста опухания лапы (ВТОЛ) каждого животного в относительные величины интегрального показателя в баллах по стандартной шкале [4]. Унифицированная технология постановки методики позволяет использовать известные количественные критерии [9] для оценки степени аллергенной активности и установления класса аллергенной опасности белоксодержащих субстанций дрожжевых грибов.

В данной постановке альтернативной методики получены результаты, представленные в таблице.

У животных 1-й опытной группы среднегрупповая величина абсолютного показателя провокационной внутрикожной пробы превышала контрольный уровень в 2,4 раза, а величина относительного показателя ВТОЛ в 8,8 раз была выше таковой в контрольной группе А ( t = 4,71; р <0,001). Причем в опытной группе положительные кожные реакции в баллах на провокационную пробу с тест-дозой ЭСХД интенсивностью 1-3 балла регистрировались у 10 из 12 мышей (83 % животных). Соответственно, рассчитанный статистический показатель критерия Х различия между группами сравнения равнялся 6,77 (р <0,01).

Схожие результаты получены и при сенсибилизации белых мышей ЭССД: кожные реакции на провокационную пробу с тест-дозой ЭССД с высокой выраженностью (1-4 балла) выявлены у 83 % животных 2-й опытной группы. А среднегрупповые величины как абсолютного, так и относительного показателей ВТОЛ соответственно в 2,5 и 17,8 раза превышали их в контрольной группе Б ( t = 3,98 и 4,12; р <0,001). Статистические различия относительного показателя ВТОЛ между опытной и контрольной группами животных были достоверны при р <0,01 по критерию Х (6,93).

Несколько более высокие уровни абсолютного и относительного показателей ВТОЛ регистрировали у сенсибилизированных ЭСВД белых мышей, среднегрупповые величины которых у животных 3-й опытной группы превышали их в контрольной группе А в 3,0 и 9,6 раза, соответственно ( t =3,82 и 4,30; р <0,001). Частота опытных белых мышей 3-й группы с выраженными кожными реакциями (1-3 балла) составила 81,8 %, а установленное по критерию Х (7,05) различие величины относительного показателя ВТОЛ в опытной и контрольной группах животных было достоверно при р <0,01 (таблица).

Частота и выраженность показателей прямой и перекрестной провокационной пробы ВТОЛ у белых мышей, сенсибилизированных экстрактами из сухих хлебопекарных (ЭСХД), винных (ЭСВД) и спиртовых (ЭССД) дрожжевых грибов

Группа	Показатели ГЗТ по ВТОЛ	Экстракты из сухих дрожжевых грибов
		ЭСХД	ЭСВД	ЭССД
Контрольная группа А	10 "2 мм	7,88 ± 1,30	7,78 ± 1,10	-
	Н	2/12	2/12	-
	Балл	0,17 ± 0,10	0,17±0,10	-
Контрольная группа Б	10 "2 мм	-	-	7,76±1,16
	Н	-	-	1/12
	Балл	-	-	0,08 ± 0,08
1-я опытная группа ЭСХД	10 "2 мм	19,0 ± 2,30**	-	15,5 ± 2,24*
	Н	10/12	-	9/12
	Балл	1,50 ± 0,30** 1)	-	1,08 ± 0,22** 1)
2-я опытная группа ЭССД	10 "2 мм	-	13,7 ± 1,70*	19,6 ± 2,74**
	Н	-	9/12	10/12
	Балл	-	1,00 ± 0,20* 1)	1,42±0,31** 1)
3-я опытная группа ЭСВД	10 "2 мм	18,2 ± 2,60*	23,6 ± 3,40**	-
	Н	9/11	9/11	-
	Балл	1,18 ± 0,30* 1)	1,64 ± 0,30** 1)	-

П р и м е ч а н и е : * - достоверные различия с контролем при р <0,01 по критерию t ; ** - достоверные различия с контролем при р <0,001 по критерию t ; 1) - достоверные различия с контролем при р <0,01 по критерию Х ; Н: числитель - количество животных с положительными результатами ВТОЛ, знаменатель - всего в группе.

Следовательно, в стандартных условиях эксперимента экстракты-аллергены из СХД, ССД и СВД сенсибилизировали более 75 % животных опытных групп с достоверностью различий среднеарифметических величин интегрального показателя ВТОЛ с белыми мышами контрольных групп по критерию Х при уровне значимости р <0,01. Эти данные, согласно классификационным критериям [9], характеризуют сухие хлебопекарные, винные и спиртовые дрожжевые грибы как обладающие сильной сенсибилизирующей способностью (аллергенной активностью) и определяет отнесение их к I классу аллергенной опасности (чрезвычайно опасный производственный аллерген).

Обращает на себя внимание высокая частота и выраженность кожных реакций у сенсибилизированных животных опытных групп на перекрестное тестирование тест-аллергенами разных штаммов дрожжевых грибов, которые с высокой достоверностью превышали таковые у белых мышей соответствующих контрольных групп ( р < 0,01 по критериям t и Х ). Причем уровни как абсолютного, так и относительного показателей ВТОЛ у животных опытных групп на перекрестные тест-дозы экстрактов из СХД, СВД и ССД хотя и были ниже таковых на специфические экстракты-аллергены, но не имели существенной статистической разницы по выраженности и частоте выявления. Например, у животных 1-й опытной группы, сенсибилизированных ЭСХД, положительные кожные реакции на тест-аллерген ЭССД выявлены у 9 из 12 белых мышей с уровнем относительного показателя ВТОЛ 1,08 ± 0,22 балла, тогда как на специфический тест-аллерген ЭСХД – 1,50 ± 0,30 балла ( t =1,19; р >0,05).

Перекрестные реакции при использовании различных грибковых аллергенов, даже на грибы разного рода, известны достаточно давно, а антигенное родство между грибами одного вида еще более существенно [5]. Так, у сенсибилизированных клетками Candida albicans морских свинок установлены высокая частота и выраженность перекрестных аллергических реакций на антигены плесневых грибов и даже на их продуцент пенициллин [13].

Следовательно, установление наличия в сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжевых грибах общих антигенных иммунодетерминант обусловливает возможность формирования полисенсибилизации при их ингаляционном поступлении в организм и высокий риск развития перекрестных аллергических реакций у контактирующих с ними лиц.

Данный факт имеет важное значение, поскольку позволяет учитывать его в обосновании единой ПДК врз , используя нормированный штамм сухих дрожжевых клеток в качестве референс-аллергена.

Выводы. Результаты выполненных экспериментальных исследований позволяют сделать следующие выводы:

• 1.    С использованием разработанного оригинального способа, основанного на окислительном гидролизе органической кислотой поверхностных β-глюкозидных связей между элементарными звеньями азотсодержащего полисахарида (хитин) клеточной стенки грибов и последующем экстрагировании в щелочной среде, получены экстракты-аллергены из сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжевых грибов с высоким содержанием растворимых белоксодержащих субстанций, достаточным для экспериментального моделирования их воздействия на организм и выявления особенностей биологического действия.

• 2.    Обоснована альтернативная краткосрочная методика, включающая унифицированную технологию воспроизведения и объективного выявления гиперчувствительности замедленного типа в эксперименте на белых мышах, которая позволяет установить степень аллергенной активности и класс аллергенной опасности веществ биологической природы по их растворимым белково-антигенным субстанциям.

• 3.    Экспериментально установлено, что белково-антигенные комплексы сухих хлебопекарных, винных и спиртовых дрожжевых грибов обладают сильной сенсибилизирующей способностью (аллергенной активностью) и отнесены к I классу аллергенной опасности (чрезвычайно опасный производственный аллерген).

• 4.    Хлебопекарные, винные и спиртовые дрожжевые грибы имеют общие антигенные иммунодетерминанты, что определяет высокую вероятность формирования полисенсибилизации организма при их ингаляционном воздействии в производственных условиях и высокий риск развития перекрестных аллергических реакций у контактирующих с ними лиц.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.