Универсальный режим сублимационного высушивания пробиотиков

E-mail: analisbio@permonline.ru

УНИВЕРСАЛЬНЫЙ РЕЖИМ СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ ПРОБИОТИКОВ

ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ Филиал «Пермское НПО «Биомед»

Способ получения медицинских пробиотических препаратов (лакто-, бифидумбактерин и др.) базируется, как правило, на использовании технологической схемы, включающей в качестве основных стадий, помимо процесса культивирования штаммов, стабилизацию бактериальной культуры и изготовление лекарственных форм. Стабилизация бактериальной культуры необходима для обеспечения жизнеспособности клеток в препарате, что определяет срок его годности.

Из многих известных способов сохранения бактериальных культур к пригодным для массового производства лекарственных форм пробиотиков относится лиофилизация – высушивание из замороженного состояния. Лиофильное высушивание является надежным способом сохранения биоматериалов. Выживание клеток в этом случае обеспечивается за счет естественной способности микроорганизмов впадать в анабиоз при неблагоприятных условиях внешней среды [1, 2]. В лиофилизированных культурах значительная часть бактерий сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение многих лет, не теряя при этом биологических свойств. Техническая доступность данного вида стабилизации бактериальных культур обеспечила ему широкое распространение, в том числе в производстве пробиотических препаратов.

Повышение эффективности использования сублимационной техники при традиционном выпуске пробиотиков в виде сухой биомассы во флаконах предполагает значительное снижение продолжительности операции лиофилизации препаратов и ее унификацию.

Предпосылки к разработке единых режимов замораживания и высушивания для разных препаратов базировались на применении аналогичных за-74

щитных сред и объемов наполнения флаконов. Кроме того, использование унифицированных питательных сред (казеиново-дрожжевые) для культивирования лакто- и бифидобактерий и близкий по составу спектр продуцируемых ими экзометаболитов также способствовали реализации данного направления исследований.

Препараты разливали в инсулиновые флаконы ФИ-5 по 2 мл (5 доз). Высота (толщина) вертикального столба препарата при таком объеме розлива составляла (13±1) мм и зависела от вариабельности диаметра флакона. Замораживали препарат в низкотемпературных шкафах TV-2000 (Германия) холодовым воздействием на уровне минус 50°С не более 20 ч как в вертикальном, так и в наклонном положении под углом (60±15)°. В ходе высушивания на установке ТГ-50 (Германия) применяли интенсивный нагрев полок со скоростью до 20°С/ч.

При отработке единого режима замораживания препаратов не возникло каких-либо затруднений, так как процесс сверхмедленного охлаждения (менее 1°С/мин) обеспечивает первичную и вторичную кристаллизацию влаги в бактериальных суспензиях без существенного негативного влияния на жизнеспособность клеток [2]. При заданной температуре (минус 50°С) гарантированно достигается полное замораживание суспензии лакто- и бифидобактерий, эвтектические параметры которых охватываются диапазоном минус (38±6)°С. Практически этот режим может быть использован в производстве всех пробиотических препаратов, так как при его осуществлении нивелируется роль объема наполнения флаконов и состава защитной среды.

При отработке оптимального унифицированного режима сублимационного высушивания препаратов необходимо было подобрать и адаптировать к техническим возможностям каждой сушильной установки максимально короткие этапы собственно сублимации и досушивания, обеспечивающие сохранение необходимой структуры биомассы и жизнеспособности клеток. Известно, что длительность этапа сублимации, когда удаляется до 90% всей влаги, пропорциональна объему наполнения флакона и зависит от температуры материала, состава защитной среды и толщины (высоты) замороженного слоя. Недостаточная продолжительность этого этапа может привести к резкому нарушению макроструктуры полученного препарата.

Практика лиофилизации свидетельствует, что избежать подобного, а также исключить проявления неравномерного высушивания, пересушивания и повреждения бактерий в поверхностных слоях биоматериала можно при толщине слоя не более 12 мм или, соответственно, наполнении флаконов не более 35% от их объема [2]. Указанные условия объективно подчеркивали основную проблему данной разработки, связанную с тем, что обоснованная с точки зрения эффективности препарата дозировка (5 доз

Таблица

Влияние способа замораживания на параметры лиофилизированных препаратов

Примечание: * – при 50°С в течение 16 ч; ** – под углом 45.

в объеме 2 мл) во флаконе ФИ-5 (инсулиновый) обладает критическими (пограничными) параметрами с позиции технологических возможностей. Высота (толщина) вертикального столба препарата при таком наполнении флакона составляет (13±1) мм.

Снижение объема наполнения флакона за счет уменьшения дозировки препарата экономически нерационально, так как вызывает существенное увеличение себестоимости единицы готовой продукции. Применение концентрирования бактериальной суспензии объективно приводит к снижению эффективности препарата из-за удаления из культуральной жидкости биологически активных компонентов.

Наше решение данной проблемы базировалось на использовании технологического приема, связанного с увеличением площади свободной поверхности замороженного препарата и, соответственно, ускорением процесса сублимации. Данный эффект обусловлен тем, что фронт десорбции пара проходит параллельно верхней поверхности материала и его глубина при этом значительно уменьшается. Замороженный в кассете в наклонном положении под углом (60±15)° флакон позволяет вдвое увеличить площадь открытой поверхности продукта.

Сравнительный анализ параллельно высушенных в одном сублиматоре образцов ацилакта, лакто-и бифидумбактерина с вертикальной и наклонной заморозкой флаконов показал, что наклонная заморозка позволяет снизить количество некондиционных по макроструктуре образцов бифидумбактери-на (в 3 раза), лактобактерина (в 5 раз) и ацилакта (в 4 раза) по сравнению с вертикальным вариантом. При этом биологические параметры тех и других образцов не имеют отличий (табл.).

После отработки этапа сублимации, отличительной особенностью которого является ускоренный нагрев полок до максимальной температуры (35±5)°С, необходимо было определить оптимальную длительность этапа досушивания препаратов. В ходе многочисленных экспериментов было установлено, что выдерживание продукта на плюсовых температурах в течение (20±4) ч обеспечивает остаточную влажность основной массы готового препарата в диапазоне 1-2%. Такие параметры обеспечивают высокую стабильность биологических показателей ацилакта, лакто- и бифидумбактерина на протяжении регламентированного срока хранения (годности).

Разработанный универсальный режим лиофилизации пробиотиков, включающий наклонное замораживание препаратов во флаконах и интенсивный нагрев полок на этапе сублимации при определенных значениях показателей вакуума и температуры конденсатора, признан изобретением (Патент РФ № 2333161). Указанный режим в настоящее время используется при изготовлении лакто- и бифидум-бактерина в Пермском филиале ФГУП «НПО «Микроген».

Представленные результаты исследований в сфере технологии флаконных форм препаратов послужили основой для совершенствования производственного процесса стабилизации пробиотиков и позволили в 1,5 раза увеличить эффективность использования парка сублимационного оборудования, а также снизить расходы на единицу готовой продукции.