Уровень антимюллерова гормона у взрослых кобелей собак в зависимости от возраста и состояния гонад

Антимюллеров гормон (АМГ) является одним из наиболее интересных маркеров репродуктивной системы у млекопитающих, появившийся за последние годы. АМГ представляет собой гликопротеин, принадлежащий суперсемейству трансформирующего фактора роста-B ( TGF-B) [10, 13]. В пренатальный период у самцов млекопитающих АМГ обеспечивает регрессию мюллеровых протоков. В среднем это происходит у животных во второй трети эмбриогенеза. Так у плодов крыс мужского пола регрессия мюллеровых протоков и соответственно продукция АМГ клетками Сертоли начинается на 13-й день беременности [7], а у собак у плодов мужского пола продукция АМГ начинается на 36-46 день беременности [11]. Отсутствие АМГ или рецептора АМГ типа 2 (AMHR-2) в этот период приводит к сохранению мюллерова протока [8, 9]. АМГ является одним из ключевых факторов, определяющих мужской пол и регулирующий функционирование репродуктивной системы у млекопитающих. В постнатальный период этот гормон регулирует созревание половых клеток и функционирование половых желез [15].

Данные об изменении антимюлле-рова гормона в крови самцов млекопитающих особенно в постпубертатный период достаточно противоречивы. У жеребцов концентрация АМГ в сыворотке крови в период новорожденности высокая и сохраняется такой весь препубертатный период. После полового созревания происходит снижение концентрации АМГ в сыворотке крови [5]. Причем концентрация АМГ у жеребцов зависит от сезона года. Сниже- ние АМГ после полового созревания также описаны у крупного рогатого скота [14], овец [4] и белуг (Delphinapterus leucas) [12]. Однако имеются исследования, показывающие, что АМГ является маркером незрелых клеток Сертоли [1] и этот гормон не обнаруживается в нормальных семенниках взрослых самцов [2], его экспрессия с наступлением пубертата заканчивается. Предыдущие иммуногистохимические исследования описали экспрессию АМГ в фетальном, препубертатном, постпубертатном периодах в семенниках кобелей собак. Исследование показало, что экспрессия АМГ интенсивна в клетках Сертоли фетального семенника кобеля, снижается в препубертатном семеннике; и практически отсутствует в семенниках взрослых кобелей [3]. Изменение концентрации АМГ в сыворотке крови в постпубертатный период интактных кобелей до конца не изучено. Есть данные, что уровень АМГ у жеребцов крипторхов выше чем у интактных [5] и АМГ может использоваться в диагностике крипторхизма. На сегодняшний день для собак такой методики не существует.

В этой связи, целью исследования являлась оценка уровней циркулирующего в крови антимюллерова гормона у кобелей в постпубертатный период, а также оценка данного гормона у кобелей крипторхов.

Материал и методы исследований. Данное исследование проведено на клинически здоровых кобелях и кобелях с крипторхизмом в возрасте от 3 до 12 лет, собак мелких пород массой до 5 кг. Перед взятием крови собирали анамнез, проводили клинический осмотр. Здоровых кобелей разделили на пять групп: от 3 до 5, от 6 до

8, от 9 до 12 лет, кобели крипторхи от 3 до 5 лет и кастрированные (по 5-14 собак в группе). Для исследования кровь брали из подкожной вены предплечья в количестве 2-3 мл, затем ее отстаивали в течение 30 мин и центрифугировали при 3300 об/мин в течение 10 мин. Образцы сыворотки крови переносили в пробирки Эппендорф объемом 1,0 мл и замораживали при t -20 °C до использования в исследованиях. Размораживание и повторное замораживание не допускалось. У всех кобелей взяли образцы крови для определения АМГ и тестостерона в сыворотке крови.

Определение содержания АМГ проводили иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы «AnshLab» (США) на анализаторе Униплан согласно прилагаемой инструкции. Набор для определения АМГ - Canine AMH ELISA. Уровень тестостерона в сыворотке крови измеряли с использованием серийно выпускаемых наборов фирмы Хема согласно прилагаемой инструкции. Всего проанализировали 43 пробы. Цифровые данные, полученные в эксперименте, обработаны биометрически на персональном компьютере с использованием прикладной программы Graph Pad Prism v.8. Выборки проходили проверку на нормальность распределения по тесту Шапиро-Вилк. Проверка гипотез проводилась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и t-теста в случае необходимости. Значение p≤0,05

считалось статистически значимым. Влияние возраста на содержание в сыворотки крови АМГ, тестостерона оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Корреляционный анализ проводили с использованием критерия Пирсона. Все результаты представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего.

Результаты исследований. Содержание АМГ у интактных кобелей в сыворотке крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 22,7±3,23 нг/мл (n=25) (Lim 6,7859,82). Синтез АМГ в клетках Сертоли сохраняется на протяжении всего этого периода. Имеется тенденция к снижению АМГ с возрастом. Уровень АМГ в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p<0,0001) достоверно снижается, с 43,62±5,07 нг/мл (n=7) до 17,04±2,56 нг/мл (n=11), соответственно. Достоверного снижения с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено (Рисунок 1). Содержание тестостерона в сыворотки крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 9,02±0,79 нмоль/л (n=33) (Lim 3,33-22,7). Уровень тестостерона достоверно повышается (Рисунок 2) в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p=0,0049), с 6,88±0,82 нмоль/л (n=14) до 13,55±2,48 нмоль/л (n=6), соответственно, достоверной разницы с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено. Корреляция между содержанием в сыворотки крови АМГ и тестостерона не выявлено (r=-0,39, n=20; p=0,08).

Рисунок 1 - Содержание антимюллерова гормона в сыворотке крови собак в зависимости от возраста. По оси ординат содержание «АМГ, нг\мл»; по оси абсцисс группы.

Рисунок 2 – Содержание тестостерона в сыворотке крови собак в зависимости от возраста. По оси ординат содержание тестостерона, нмоль/л; по оси абсцисс группы.

Рисунок 3 – Содержание антимюллерова гормона в сыворотке крови собак одного возраста в

зависимости от состояния гонад. группы.

По оси ординат содержание «АМГ, нг\мл»; по оси абсцисс

Рисунок 4 – Содержание тестостерона в сыворотке крови собак одного возраста в зависимости от состояния гонад по оси ординат: содержание «тестостерона, нмоль/л»; по оси абсцисс группы

Уровень АМГ в сыворотке крови у кобелей крипторхов достоверно выше на 45 % (p=0,029), чем у кобелей с интактными гонадами того же возраста и составлял

63,6±6,51 нг/мл (n=5) (Рисунок 3). Содержание тестостерона у кобелей крипторхов в возрасте 3-5 лет составляло 7,14± 2,19 нмоль/л (n=5), достоверной разницы с интактными кобелями не выявлено (Рисунок 4). Корреляции между содержанием в сыворотке крови АМГ и тестостерона не выявлено (r= -0,41, n=5; p=0,49). У кастрированных кобелей содержание АМГ в сыворотке крови и уровень тестостерона достоверно снижен при сравнении со всеми возрастными группами и составил 0,06±0,02 нг/мл (n=5) и 1,41±0,2 нмоль/л (n=5), соответственно. Корреляции между содержанием АМГ в сыворотке крови и тестостерона не выявлено (r=-0,014; n=5; p=0,98).

Результаты исследования показывают, что АМГ у кобелей синтезируется на протяжение всего постпубертатного периода. Концентрация АМГ в сыворотке крови значительно выше у кобелей в возрасте 3-5 лет, по сравнению с другими возрастными группами, причем резкое снижение АМГ идет в возрасте между 3-5 и 6-8 лет, далее снижение синтеза АМГ уже не так выражено, экспрессия АМГ идет на протяжении всего постбуртата. Корреляция содержания АМГ и тестостерона у кобелей собак в исследовании не найдена. Хотя ряд авторов указывали на отрицательную корреляцию АМГ и тестостерона у лошадей, крупного рогатого скота [14], но не у овец [2]. Можно предположить, что у разных видов животных могут существовать разные механизмы регулирования дифференцировки и роста семенников, а также возможно недостаточное количество испытуемых.

У крипторхидных кобелей синтез АМГ значительно выше, чем у интактных кобелей, что позволяет предположить, что исследование содержания АМГ в сыворотке крови может быть полезным для диагностики крипторхизма у кобелей. Семенники, находящиеся в брюшной полости, подвергаются воздействию повышенной температуры. При повышенной температуре пролиферация клеток Сертоли идет интенсивнее, чем у семенников в мошонке. Также рядом авторов установлено на людях, что в семенниках, находящихся в брюшной полости нарушается гематоте-стикулярный барьер и синтез коннексина 43, что может приводить к большему выбросу АМГ в кровь [6]. Однако необходи- мо проведение дальнейшего исследования гормональной регуляции продукции АМГ у интактных и крипторхидных кобелей.

Данные, о повышении АМГ у кобелей крипторхов согласуются с данными, полученными на крипторхидных жеребцах [5]. У кастрированных кобелей уровень АМГ ниже определения порога чувствительности, что позволяет сделать вывод, что источником АМГ у кобелей является исключительно ткань семенника, тогда как тестостерон может синтезироваться и корой надпочечника в дополнении к семеннику. Концентрация АМГ в сыворотке крови может быть более специфичным маркером наличия ткани семенника, чем уровень тестостерона в сыворотке крови.

Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что весь постпубертатный период у кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови остается на относительно высоком уровне, то есть с наступлением пубертата его экспрессия не заканчивается, несмотря на его снижение с возрастом. У кастрированных кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови находился ниже порога определения, соответственно источником синтеза АМГ у кобелей собак являются исключительно семенники. У крипторхидных кобелей синтез АМГ значительно выше, чем у интактных кобелей и кастрированных, что позволяет предположить, что исследование содержания АМГ в сыворотке крови может быть полезным для диагностики крипторхизма у кобелей. Тенденция взаимного влияния между АМГ и тестостероном у кобелей собак нами не найдена. Характеристика секреции АМГ у этого вида может быть основой для дальнейшего понимания работы семенников и их функций у кобелей, а также для клинической и патологической оценки случаев патологии семенников и бесплодия.

Резюме

Целью исследования являлась оценка уровней циркулирующего в крови АМГ у кобелей в постпубертатный период, а также оценка данного гормона у кобелей крипторхов. Данное исследование проведено на клинически здоровых кобелях и кобелях с крипторхизмом в возрасте от 3 до 12 лет мелких пород собак. Результаты исследования показывают, что АМГ у кобелей синтезируется на протяжении всего постпубертатного периода. Так, в возрасте от 3 до 12 лет уровень АМГ составил 22,7±3,23 нг/мл (n=25) (Lim 6,78-59,82). Имеется тенденция к снижению АМГ с возрастом. Уровень АМГ в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p≤0.0001) достоверно снижается, с 43,62±5,07 нг/мл (n=7) до 17,04±2,56 нг/мл (n=11), соответственно. Содержание тестостерона в сыворотки крови в возрасте от 3 до 12 лет составило 9,02±

0,79 нмоль/л (n=33) (Lim 3,33-22,7). Уровень тестостерона достоверно повышается в возрасте между 3-5 и 6-8 лет (p=0,0049), с 6,88±0,82 нмоль/л (n=14) до 13,55±2,48 нмоль/л (n=6), соответственно, достоверной разницы с 6-8 до 9-12 лет не обнаружено. Корреляция между содержанием в сыворотки крови АМГ и тестостерона не выявлено (r=-0,39, n=20; p=0,08).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что весь постпубертатный период у кобелей собак уровень АМГ в сыворотки крови остается на относительно высоком уровне. Источником синтеза АМГ у кобелей собак являются исключительно семенники.