Уровень CD45+-, CD3+-клеток в печени при физической активности разной степени и после введения мельдония

EDN: TVPMZT

1 Введение. Положительное влияние спорта на здоровье никогда не подлежало сомнению и уже давно научно доказано. Однако высока вероятность развития внезапной смерти вследствие острых физических перенапряжений, возникающих при чрезмерной нагрузке во время тренировки или соревнования [1–5]. Внезапная смерть молодого и очевидно здорового человека становится настоящей трагедией для общества и семьи, особенно если это связано со спортсменами, которые всегда были символом здоровья и силы. Развитие неблагоприятного исхода связано с нарушением режима выполнения физических упражнений, особенно при наличии скрытой патологии, для которой интенсивное перенапряжение становится триггерным фактором.

Печень является иммунным органом, в ней располагаются клетки врожденного и адаптивного иммунитета [6-8]. Популяции лейкоцитов в печени осуществляют защитный барьер, способствуя притоку в нее лимфоцитов [9]. Лимфоциты взаимодействуют с гепатоцитами благодаря фенестрированному эндотелию и отсутствию базальной мембраны, что облегчает межклеточные контакты между резидентными иммунными клетками и негемопоэтическими клетками печени [10]; возникает прайминг лимфоцитов с формированием иммунного ответа на различные факторы. Дисрегуляторные механизмы приводят к развитию воспалительной реакции, нарушению архитектоники органа с возникновением фиброза. В этих процессах участвуют лейкоциты, различные популяции Т-лимфоцитов [10, 11]. Изучение реакции лейко-, лимфоцитов в альтеративных процессах и восстановлении печени может служить основой для поиска способов коррекции этих изменений. Одним из препаратов с доказанным действием является мельдоний, который оказывает мембранопротекторное влияние, способствующее восстановлению цитоплазматических выростов - микроворсинок гепатоцитов, улучшает метаболизм клеток, способствует эффективному транспорту АТФ и оптимизирует потребления клетками кислорода [12].

Цель – оценить долю лейкоцитов (CD45+-клеток) и Т-лимфоцитов (CD3+-клеток) в печени при физической активности разной степени при использовании мельдония и без него.

Материал и методы. Опыты проводились на линейных самцах – крысах линии Вистар ( n =60) весом 240 г. Животным давали физическую нагрузку разной интенсивности. Так, 1-й группе крыс давали легкую физическую нагрузку, для чего их помещали в ванну с температурой воды 29-32°С, в которой животные плавали 15 мин. Крысы 2-й группы проводили в ванне 30 мин – нагрузку расценивали как средней тяжести. Для воспроизведения тяжелой физической нагрузки (3-я группа) животные плавали в ванной до тех пор, пока они не начинали терять силы и тонуть. Обычно это наступало через 55–59 мин после нахождения животных в воде [2, 3]. Всего выполнено 10 сеансов плавания. Затем животных выводили их эксперимента сразу после последнего сеанса (10 животных на группу) и через 30 сут после окончания опытов (10 животных на группу). В пищу опытных животных добавляли мельдоний из расчета 100–20 мг/кг веса

1 Ответственный автор – Александр Аринариевич Юсов

Corresponding author – Alexandr A. Yusov

при выполнении водной нагрузки. Для сравнения результатов использовали 3 контрольные группы крыс (по 10 на группу), которые также выполняли аналогичную нагрузку разной степени тяжести, но в пищу которых мельдоний не добавляли, и интактную группу, особи которой нагрузку не выполняли.

Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли в соответствии с ГОСТ 33216–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами». Дизайн эксперимента одобрен на заседании этического комитета ФГБОУ ВО «Марийский государственный университет» (протокол №1 от 28.04.2023).

Животных умерщвляли путем декапитации на гильотине. После выведения животных из эксперимента для исследования атравматично забирали печень. Фиксировали части правой доли печени в 10% формалине в фосфатном буфере, проводили заливку в парафин и готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм, используя гистопроцессор МТР-120 (SLEE Medical GmbH, Германия) и Tissue-Tek® TEC™ 5 (Sakura Seiki Co, Япония). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Проводили иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию на маркеры CD-45 (первичное антитело: клон, производитель, разведение – Purified Mouse Anti-Rat CD45 клон OX-1, BD Pharmingentm, США, 1:30; вторичное антитело: клон, производитель, разведение – Biotin Goat Anti-Mouse Ig, Multiple Adsorption, поликлональное, BD Biosciences, США, 1:50 и CD-3 Purified Mouse AntiRat CD3 клон G 4.18, BD Pharmingentm, США, 1:30; Biotin Goat Anti-Mouse Ig, Multiple Adsorption, поликлональное, BD Biosciences, США, 1:50) по стандартной методике. Для идентификации антигенных детерминант использовался непрямой пероксидазный метод. Подсчитывали клетки в 40 полях зрения (1 мм 2 среза).

Статистическую обработку проводили в Statistica Application версии 10.0.228.2 (StatSoft, США). Нормальность распределения данных определяли с использованием теста Колмогорова - Смирнова и Лил-лиефорса. Для определения значимости различий между группами использован однофакторный дисперсионный анализ – ANOVA (ANalysis Of VAriance) с последующим тестом высокозначимых различий Тьюки p ≤0,05. При распределении, отличающемся от нормального, использовался ANOVA Краскела - Уоллиса, а затем проводились попарные сравнения с помощью критерия Манна – Уитни.

Результаты. При легкой физической нагрузке гистологически в печени выявлялось полнокровие, незначительные дистрофические изменения. Процент CD45-позитивных клеток не изменился как без использования мельдония, так и с его применением (табл. 1, 2). При средней физической нагрузке определялась выраженная дистрофия и некробиотиче-ские изменения (рис. 1, а, б ). При ИГХ-реакции выявлялись изменения в показателе CD45+-клеток, что сопровождалось увеличением процента клеток в паренхиме печени: доля CD45+-клеток возросла в 1,8 раза (см. табл. 1) и периваскулярно в 2 раза ( р =0,002) при сопоставлении с результатами интактной группы (см. табл. 1). В 3-й группе гистологически в печени была гидропическая дистрофия печеночных клеток с вовлечением центролобулярной зоны и баллонная дегенерация перипортальных гепатоцитов, а также некробиотические изменения и участки некроза:

Таблица 1

Группа	CD45+-клетки в паренхиме печени n/мм2 (%)	Min/max	CD45+-клетки около сосудов печени, n/мм2 (%)	Min/max	Общее количество CD3+-клеток в срезе печени, n/мм2 (%)
Интактная	12,1±2,1	7,4–19,9	16,4±2,9	9,3–26,4	28,5±2,1
Опытные группы
1-я	12,9±1,9/12,3±1,7	9,1–17,8/9,2–17,5	16,9±2,2/16,6±1,8	9,5–22,4/9,8–22,9	29,8±1,9/28,9±1,9
2-я	21,4±3,2/17,9±1,4	16,5–26,9/13,4–24,2	32,3±3,7*/21,9±1,6 р =0,002	26,2–41,3/17,4–32,1	53,7±3,2/39,8±1,4
3-я	38,3±4,2/ 21,2±2,9	32,6–41,5/15,8–26,5	49,9±4,8** р =0,001 29,7±1,9*** р =0,008	38,9–55,6/21,3–36,7	88,2±4,2/50,9±2,9
Через 30 сут после эксперимента
Физическая активность
Легкая	12,3±2,2/12,2±1,2	8,9–17,5/9,0–17,2	16,5±2,5/16,6±2,1	10,2–21,8/10,4–21,6	28,8±2,2/28,8±1,2
Средняя	18,1±2,1/13,1±1,9	14,7–23,5/9,2–26,4	21,3±3,9/17,1±1,5**** р =0,004	17,3–28,9/14,1–23,2	38,4±2,1/30,2±1,9
Тяжелая	37,8±3,3/17,8±3,1	29,4–43,1/ 14,5–23,8	48,4±5,1/20,6±4,3***** р =0,002	39,2–52,4/17,3–26,1	86,2±3,3/38,4±3,1

Примечание. Здесь и далее в табл. 2 уровни статистической значимости различий: *2-й группы с интактной; **3-й группы (без мельдония) с интактной; ***3-й группы без введения мельдония и с его применением; через 30 сут после эксперимента: ****2-й группы с мельдонием) с интактной группой; *****3-й группы без введения мельдония и с его применением.

Таблица 2

Доля CD3+-клеток (%) при введении мельдония и без его применения

Группа	CD45+-клетки в паренхиме печени n/мм2 (%)	Min/max	CD45+-клетки около сосудов печени, n/мм2 (%)	Min/max	Общее количество CD3+-клеток в срезе печени, n/мм2 (%)
Интактная	2,4±1,3	1,8–4,4	3,8±1,7	2,1–8,0	6,2±1,3
1-я	2,8±1,7/2,7±1,9	1,6–4,6/1,5–4,1	4,1±1,5/3,9±1,5	2,2–8,8/2,1–8,3	6,9±1,7/6,6±1,7
2-я	5,6±2,6/3,8±2,3	2,9–9,9/1,9–5,9	14,3±1,8*/4,9±1,4 р =0,04	7,9–23,3/2,3–8,9	19,9±1,3/8,7±2,1
3-я	6,9±1,1/4,1±1,7	3,8–9,8/2,2–7,6	23,8±2,1** р =0,001 8,8±1,8*** р =0,004	17,2–31,8/ 5,2–12,4	30,7±3,1/12,9±2,3
Через 30 сут после эксперимента
Физическая активность
Легкая	2,7±0,9/2,6±1,9	1,2–4,4/1,1–4,2	3,9±0,8/3,8±1,3	1,8–7,1/1,7–7,0	6,6±1,3/6,4±1,1
Средняя	7,5±0,8/3,5±1,7	4,2–8,9/2,2–6,9	13,8±0,6****/4,6±1,6 р =0,006	6,2–19,7/2,2–8,8	21,3±1,3/8,1±1,8
Тяжелая	9,7±0,8/3,9±1,2	5,6–16,3/2,1–6,8	21,9±2,7*****/6,8±2,1 р =0,004	15,9–32,4/3,2– 11,4	28,6±1,3/10,7±1,9

Показатели CD45+-клеток (%) в условиях эксперимента и при введении мельдония

ядра были в состоянии кариопикноза и кариолизиса (см. рис. 1, в ). Остатки слабо эозинофильной цитоплазмы определялись вокруг ядер или вдоль мембран клеток. Выявлялась выраженная воспалительная инфильтрация в ткани печени (см. рис. 1, г ). При ИГХ-реакции отмечались следующие изменения: доля CD45+-клеток паренхимы печени повысились в 3,2 раза и периваскулярно в 3 раза ( р =0,001) в сравнении с интактной группой (см. табл. 1). После применения мельдония при тяжелой физической нагрузке процент CD45+-клеток уменьшился в паренхиме печени и периваскулярно в 1,8 раза ( р =0,008) по сравнению с интактной группой (см. табл. 1).

Через 30 сут после эксперимента при легкой и средней физической активности наблюдалась нормализация гистологической картины печени, отсутствовали дистрофические и некробиотические изменения. Процент CD45+-клеток был в пределах значений интактной группы (см. табл. 1). При тяжелой физической нагрузке отмечались небольшие участки соединительной ткани в периферических отделах печеночных долек. Распределение CD45+-клеток было следующим: в паренхиме печени показатель снизился в 2,1 раза и периваскулярно в 2,3 раза в сравнении с группой животных, которым мельдоний не вводили (тяжелая физическая активность; см. табл. 1).

А

В

Б

Г

Рис. 1. Микроскопические изменения в печени: А – у интактных животных: а – центральная вена; б – печеночные балки;

Б – 2-я группа: а – некробиоз отдельных клеток; В – 3-я группа: а – клетки с кариолизисом; Г – а – клеточная инфильтрация.

Окраска гематоксилином и эозином, ув. 400

При ИГХ-реакции на CD3+-клетки обнаружено, что при легкой физической нагрузке значимых изменений не выявлено как без введения мельдония, так и с использованием препарата. При средней физической активности без использования медьдония процент CD3+-клеток повысился в 3,8 раза ( р =0,04) периваскулярно в сравнении с интактной группой и был выше в 2,9 раза ( р =0,02), чем во 2-й группе с использованием мельдония. При тяжелой физической нагрузке процент клеток возрос как в паренхиме органа в 2,9 раза, так и периваскулярно в 6,3 раза ( р =0,001) по сравнению с интактной группой (см. табл. 1). Визуализировались скопления CD3+-клеток и в разных полях зрения CD3+-клетки были в виде цепочек, окружающих сосуды (рис. 2). С использованием мельдония процент CD3 – клеток был ниже, чем без применения мельдония (см. табл. 1).

Через 30 сут после эксперимента при легкой физической активности (без использования мельдония и с применением препарата) процент CD3+-клеток не изменился при сопоставлении с показателями интактной группы. При средней физической активности (с использованием мельдония) отмечалось снижение доли СD3+-клеток в паренхиме в 2 раза и периваскулярно в 3 раза ( р =0,006) по сравнению с животными, у которых мельдоний не использовали. При тяжелой физической нагрузке (с применением мельдония) процент CD3+-клеток паренхимы печени уменьшился в 2,5 раза и периваскулярно в 3,2 раза ( р =0,004) в сравнении с группой животных без использования препарата.

Обсуждение. Проведенное исследование установило, что при легкой физической активности (без применения мельдония и с таковым) не отмечалось значимых изменений в проценте CD45+-клеток. При средней физической активности происходило повышение процента лейкоцитов (CD45+-клеток). При тяжелой физической активности возрастала доля CD45+-клеток периваскулярно и в паренхиме печени, что было отличием от группы интактных животных. При гистологическом исследовании выявлялись некротическая и экссудативная реакции, сопровождаемые некробиозом, некрозом клеток с воспалительной инфильтрацией. Использование мельдония при выполнении животными водной нагрузки умеренной и тяжелой степеней изменяло ИГХ-картину срезов печени: происходило уменьшение процента CD45+-клеток как периваскулярно, так и в паренхиме печени. Однако доля CD45+-клеток при изучаемых нагрузках оставалась выше, чем в интактной группе. Через 30 сут после эксперимента процент CD45+-клеток достигал цифр интактных животных при средней физической нагрузке, а при тяжелой оставался незначительно выше, чем в интактной группе.

Процент T-лимфоцитов в группе легкой физической активности (с применением мельдония и без его использования) не изменялся в сравнении с интактными животными. При средней и тяжелой интенсивности нагрузки процент CD3+-клеток возрос в сравнении с показателями интактной группы. Увеличение процента CD3+-клеток было связано с

Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция на CD3+-клетки в печени: а – у интактных животных;

б – на фоне вакуольной дистрофии группы, состоящие из CD3+-клеток;

в, г – скопления CD3+-клеток периваскулярно и в паренхиме печени (коричневые клетки-стрелки);

а, в – ув. 100; б, г – ув. 400

воспалительной реакцией в печени, ассоциированной Т-лимфоцитами. При использовании мельдония при средней и тяжелой нагрузках изучаемый показатель снизился, но еще оставался выше, чем в интактной группе. Через 30 сут после окончания эксперимента при средней интенсивности нагрузки процент CD3+-клеток приблизился к цифрам интактной группы. Это связано с высокими регенераторными способностями печени, восстановлением гистоархитектоники данного органа и отсутствием деструктивных изменений в нем. При тяжелой физической активности с использованием мельдония также происходило статистически значимое снижение изучаемого показателя как в паренхиме печени, так и пери-васкулярно.

По данным некоторых авторов [13], в период интенсивных тренировок в крови уменьшался общий уровень Т-клеток (CD3+), лимфоцитов-хелперов при сохранении доли супрессоров. Активность Т-лимфоцитов (синтез ДНК и реакция на Т-митоген) оставалась повышенной. Авторы установили, что уменьшение в крови популяции CD3+-, CD4+-клеток свидетельствовало о нарушении уровня клеточной иммунной защиты.

В другом исследовании авторы установили, что при физической нагрузке в ходе субхронического эксперимента возрастал уровень нейтро- и эозинофилов, это согласовалось с данными о том, что физические упражнения могут быть сопряжены с воспалением и способствовать выработке интерлейкинов, а также увеличению циркулирующих нейтро- и эозинофилов [14]. Согласно исследованию Е.Н. Ермолаевой и соавт. [15], у крыс, которые выполняли тренировки умеренной и субмаксимальной мощности, возрастал уровень лейкоцитов.

По данным исследователей, изучающих действие токсиканта CCl4 на печень, было выявлено возрастание СD45+- и СD3+-клеток с развитием лимфолейкоцитарной инфильтрации в печени. Использование препарата аминофталгидразида приводило к снижению лейкоцитарной инфильтрации и резкому уменьшение уровня СD45+- и СD3+-клеток до значений интактных животных [16].

Заключение. При тяжелой физической активности без использования мельдония в печени развивалась лимфолейкоцитарная инфильтрация, указывающая на реакцию клеточного звена иммуногенеза. После приема мельдония отмечалось снижение процента CD45+- и CD3+-клеток из-за уменьшения воспалительной инфильтрации в ткани печени и деструктивных изменений.

Вклад авторов. Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.