Усиление цитотоксическои активности мононуклеаров периферической крови человека и торможение роста опухоли у мышей под воздействием бактериального иммуномодулятора

Значительный прогресс в патогенетической терапии онкологических и инфекционных заболеваний обещают вновь созданные имму- номодулирующие препараты, регулирующие клеточные и молекулярные реакции организма [3, 4, 8]. Целесообразность применения бактери- альных иммуномодуляторов в онкологической практике определяется наличием в их составе патоген-ассоциированных молекулярных структур (ПАМС), влияющих на различные звенья иммунной системы. Под действием бактериальных иммуномодуляторов происходит активация макрофагов, лимфоцитов, натуральных киллеров (НK) и других факторов естественной резистентности организма, супрессированных под влиянием опухолевого процесса, оперативного вмешательства, химио- и лучевой терапии [5, 7, 12]. Одним из таких препаратов является разработанная в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова бесклеточная поликомпо-нентная вакцина из антигенов условно-патогенных микроорганизмов Иммуновак-ВП-4.

Проведённые нами ранее исследования действия ВП-4 на эффекторную систему врождённого иммунитета показали, что она является индуктором созревания дендритных клеток, усиливая процессинг антигена, увеличивая экспрессию костимулирующих, адгезивных молекул и молекул антигенного представления, повышая продукцию противовоспалительных и регуляторных цитокинов, а также стимулирует активность НК-клеток [1]. Именно натуральным киллерам отводится ключевая роль в противоопухолевой защите, так как они способны уничтожать клетки-мишени с любыми нарушениями, в том числе и опухолевые клетки, без участия специфических рецепторов и главного комплексагистосовместимости [9, 14].

Для оценки противоопухолевой активности иммуномодулирующих препаратов применяют методы, позволяющие определить in vitro уровень спонтанной и стимулированной митогенами цитотоксичности мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК). Использование митогенов дает возможность проводить сравнительное изучение стимулированной ими и исследуемыми иммуномодулирующими препаратами киллерной активности МЛПК по отношению к опухолевым клеткам-мишеням [6].

Цель работы – провести сравнительное исследование влияния бактериальной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов и митогенов растительного и бактериального происхождения на цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови здоровых доноров и оценить влияние вакцины ВП-4 на рост опухоли у мышей с меланомой В16.

Материал и методы

Мононуклеарные лейкоциты периферической крови (МЛПК) выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови 15 здоровых доноров. Кровь, разведенную в 2 раза средой 199, центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урографина (Pharmacia, плотностью 1,077 г/см3). Мононуклеарные лейкоциты, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объёме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g.

Культивирование клеток К562 и Соlo. Клетки-мишени перевиваемой НК-чувствительной опухолевой линии К-562 (эритробластный лейкоз человека) и Соlo (колоректальный рак человека) культивировали в аналогичных условиях – среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 5 % фетальной сыворотки (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина при 370С в атмосфере 4 % СО2. Клетки НК-чувствительных опухолевых линий предоставлены лабораторией клеточного иммунитета Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина.

Препараты. В работе использовали Т-кле-точный митоген –фитогемагглютинин (ФГА) (ПанЭко, Россия), В-клеточные митогены – ЛПС Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (Sigma, США), поликомпонентную вакцину Иммуно-вак-ВП-4 из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (ГУ «НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН», патент № 2083223 от 27.05.94). Вакцина разрешена к применению в практике здравоохранения РФ парентеральным и интра-нозальным методами (Приказ МЗ РФ № 270 от 17.11.93), рекомендована для профилактики и терапии гнойно-воспалительных заболеваний.

Иммуновак-ВП-4 является оригинальным препаратом, в конструировании которого использованы антигенные компоненты, извлеченные из S. aureus, K.pneumoniae, Proteus vulgaris, E. coli. Для приготовления вакцины были селектированы штаммы, обладающие высокой иммуногенной активностью, слабыми сенсибилизирующими свойствами и широкой перекрестной протективной активностью антигенов. Препарат не содержит консервантов и стабилизирующих добавок, включает пептидогликан и тейхоевые кислоты. ВП-4 является активным стимулятором иммунитета в отношении ряда этиологически значимых условно-патогенных микроорганизмов. Выявлено, что вакцина ВП-4 обладает как иммуномодулирующими свойствами, активируя естественные защитные механизмы, так и усиливает протективный иммунитет, предупреждает оппортунистические инфекции. Высокая степень защиты ВП-4 была установлена в многочисленных экспериментальных исследованиях на животных в отношении всех микроорганизмов, из антигенов которых готовился препарат. Терапевтический эффект ВП-4 установлен при некоторых хронических воспалительных и аллергических заболеваниях: абсцессе легкого, хроническом бронхите, бронхиальной астме у детей и взрослых, герпесе, пиодермиях. В работе использовали десятикратные разведения указанных препаратов в дозах от 10,0 до 0,01 мкг/мл, МЛПК инкубировали с различными концентрациями этих препаратов в течение 72 ч в 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) при 37 0С и 4 % СО2.

Цитотоксический тест. Для выявления цитотоксической активности клеток использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Цитотоксическую активность МЛПК определяли на линии К-562 и Colo. Опухолевые клетки (3×104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛПК в соотношениях 1:5; 1:2,5; 1:1 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 ч при 37 0С и 4 % СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане МS (Labsystem, Финляндия) при длине волны 540 нм, рассчитывали процент лизиса опухоле-выхклеток (процент цитотоксичности).

Противоопухолевое действие ВП-4 оценивали по торможению роста пигментной метастазирующей опухоли В16 у мышей (по 20 животных в каждой группе). Штамм пигментной метастазирующей опухоли получен из лаборатории ком- бинированных методов терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина (зав. лабораторией — д.м.н. Е.М. Трещалина). Опухолевые клетки меланомы В16 имплантировали мышам подкожно в область подмышечной впадины в количестве 5х105 клеток. Вакцину вводили в дозах 200 и400 мкг внутрибрюшинно. Лечение начинали за 7 дней до имплантации опухоли, одновременно с ней и на 2-й день после имплантации. Визуально определяемые опухолевые узлы оценивали на 10, 15, 22-е сут после инокуляции.

Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Объём считали по формуле

V = A(B)2.

Торможение роста опухоли (ТРО, %) вычисляли по формуле

V k -V o

ТРО = ——— ∙ 100% ,

Vk где Vк – средний объём опухоли в контрольной группе на определённый срок измерения (мм2);

Vo – средний объём опухоли в опытной группе на определенный срок измерения (мм2).

В качестве положительного эффекта учитывалось торможение роста опухоли более 50 %.

Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стъюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 2000 (StatSoft 6.0), поскольку данный параметрический критерий обнаруживает наиболее выраженные эффекты. Данные представлены как M±m. Различия считались значимыми при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Стимулирующий эффект влияния исследуемой бактериальной вакцины на цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов периферической крови сравнивали с действием неспецифических поликлональных активаторов: Т-клеточного митогена – ФГА и В-клеточных митогенов – ЛПС K. pneumoniae и E. coli.

Было установлено отсутствие прямого цитотоксического действия препаратов на опухолевые клетки Colo в концентрациях от 0,1 до 10,0 мкг/мл. Максимальная спонтанная киллерная активность МЛПК отмечалась при

Таблица 1

Влияние поликомпонентной вакцины ВП-4 и митогенов на цитотоксичность МЛПК здоровых доноров (n=15) по отношению к клеткам колоректального рака

Соотношение опухоле-ваяклет-ка/МЛПК	Спонтанная цитотоксичность МЛПК	Концентрация препарата, мкг/мл	Цитотоксичность МЛПК (%) при внесении в среду культивирования опухолевых клеток Colo препаратов				Достоверность различий между группами препаратов
			ФГА	ЛПС		ВП-4
				K. pneumoniae	E. coli
1:5	38,0 ±1 ,0	10,0	85,4 ± 1,7**	73,0 ± 0,8**	75,1 ± 1,5**	87,5 ± 1,8**	р4 и 2,3<0,001
		1,0	73,8 ± 1,1**	50,9 ± 2,0**	53,1 ± 1,7**	74,9 ± 1,6**	р4 и 2,3<0,001
		0,1	45,2 ± 4,1*	42,5 ± 0,8*	44,0 ± 4,0*	46,6 ± 1,5*	р4 и 1,2,3>0,05
1:2,5	32,6 ± 0,9	10,0	73,0 ± 1,6**	40,0 ± 1,6*	41,0 ± 1,3*	56,0 ± 1,9**	р4 и 2,3<0,001 р1 и4,<0,001
		1,0	61,9 ± 2,1**	35,0 ± 1,0	33,8 ± 1,3	50,0 ± 1,6**	р4 и 2,3<0,001 р1 и 4<0,001
		0,1	57,4 ± 0,5**	34,0 ± 1,3	33,0 ± 1,0	47,9 ± 2,5**	р4 и 2,3<0,001 р1 и 4<0,01
1:1	20,9 ± 0,3	10,0	29,0 ± 0,7*	32,0 ± 0,72*	30,0 ± 1,5*	31,6 ± 0,7*	р4 и 1,2,3>0,05
		1,0	29,5 ± 0,5*	25,9 ± 5,6	26,9 ± 6,0	30,0 ± 0,35*	р4 и 2,<0,001 р4 и 3<0,001
		0,1	28,9 ± 1,7*	22,7 ± 0,72	22,6 ± 1,2	21,0 ± 1,8	р1 и 2,3,4<0,001

Примечание: * - р<0,01; ** - p<0,001, достоверность различий по сравнению с контролем.

отношении клетки мишени/ эффекторы – 1:5 (38,0 ± 1,0 %) (табл. 1). При данном соотношении клеток мишеней и эффекторов все исследуемые препараты во всех дозах оказывали наибольший стимулирующий эффект на цитотоксическую активность МЛПК. При меньших соотношениях (1:2,5; 1:1) достоверной стимулирующей активностью во всем диапазоне испытанных доз обладали бактериальная вакцина и ФГА, для ЛПС эффективной оказалась только наибольшая из концентраций (10 мкг/мл).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии прямого цитотоксического действия препаратов на клетки-мишени и подтверждают их способность стимулировать цитотоксическое действие мононуклеарных лейкоцитов. Бактериальная поликомпонентная вакцина, содержащая в своем составе не только липополисахаридные комплексы, но и другие активные ПАМС, в большей степени, чем ЛПС, стимулирует цитотоксическую активность МЛПК.

На следующем этапе работы была изучена способность исследуемых препаратов индуцировать НK-активность МЛПК по отношению к клеткам линии К-562. На основании предыдущих исследований было выбрано наиболее оптимальное соотношение клеток-мишеней и клеток-эффекторов – 1:5 (табл. 2).

Введение в среду культивирования исследуемых препаратов в концентрациях 1,0 и 10,0 мкг/мл достоверно повышало уровень цитотоксичности МЛПК здоровых доноров по отношению к лейкозным клеткам-мишеням К562 (табл. 2). Максимальный цитотоксический эффект был получен при стимуляции МЛПК бактериальной вакциной ВП-4 (81,6 ± 5,4 %). Цитотоксическая активность в этом случае превышала таковую при введении в культуры и ФГА (p<0,01), и видовых ЛПС (p<0,05–0,001). При этом наблюдался дозозависимый эффект влияния ВП-4, ФГА и ЛПС на цитотоксичность МЛПК. В минимальной из испытанных концентраций (0,1 мкг/мл) усиление НK-активности

Таблица 2

Влияние поликомпонентной вакцины ВП-4 и митогенов на цитотоксическую активность МЛПК здоровых доноров (n=15) по отношению к клеткам К562

Концентрация препарата, мкг/мл	Цитотоксичность МЛПК (%) по отношению к опухолевым клеткам К562 при внесении в среду культивирования препаратов				Достоверность различий между группами препаратов
	ФГА	ЛПС		ВП-4
		K. pneumoniae	E. coli
10	61,3 ± 2,4**	58,1 ± 3,2**	58,0 ± 6,8**	81,6 ± 5,4**	p4и 2,3<0,05 р4и1<0,01
1,0	61,6 ± 2,4**	56,7 ± 3,4**	52,7 ± 6,2*	80,3 ± 5,0**	р4и 3<0,001 р4и1,2<0,01
0,1	53,6 ± 4,9*	37,0 ± 5,6	36,5 ± 4,7	60,4 ± 3,3**	р4и 2,3<0,01

Примечание: спонтанная цитотоксичность МЛПК – 24,4 ± 4,0;

* – р<0,01; ** – p<0,001, достоверность различий по сравнению с контролем.

МЛПК по сравнению со спонтанной отмечено только при действии ФГА (р<0,01) и ВП-4 (р<0,-001). Следовательно, проведенное исследование показало преимущество ВП-4 по сравнению с ФГА, ЛПС K. pneumoniae и E. coli (в дозах от 0,1 до 10,0 мкг/мл) в отношении стимуляции цитотоксической активности МЛПК. Таким образом, бактериальная вакцина ВП-4 в большей степени, чем все испытанные митогенные референс-препараты, стимулировала киллерные свойства мононуклеарных лейкоцитов по отношению к НК-чувствительной линии клеток К562, причем достоверное повышение спонтанной НK-актив-ностивыявлялосьвдозахот 0,1 до 10 мкг/мл.

С учётом выраженного стимулирующего влияния вакцины ВП-4 на киллерную активность МЛПК были проведены исследования противоопухолевого действия данного препарата на мышах, привитых опухолевыми клетками меланомы В16. Как следует из данных, представленных в табл. 3, начиная с 10-х сут наблюдения отмечается торможение роста опухоли у животных, получивших вакцину ВП-4. При этом торможение роста опухоли при введении ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь во все сроки наблюдения не достигало 50 % (30,1–41,1 %). В то же время у животных, получавших вакцину в дозе 400 мкг/мышь, процент торможения роста опухоли колебался от 61,5 до 69,3 %. Это позволяет говорить о наличии терапевтического эффекта вакцины в данной дозировке. Однако достоверного увеличения продолжительности жизни мышей, получавших вакцину в иссле- дуемых дозах, по сравнению с контрольной группой животных не наблюдалось.

В проведенных ранее исследованиях было показано, что вакцина ВП-4, содержащая в своем составе ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, индуцирует созревание дендритных клеток, активирует различные субпопуляции лимфоцитов и обеспечивает длительный клинический эффект при заболеваниях, сопровождающихся снижением естественной резистентности организма [1, 2]. В настоящей работе дополнительно выявлены: дозозависимый эффект воздействия ВП-4 на киллерные свойства МЛПК доноров, а также ингибирующее действие на рост опухоли у мышей.

Известно, что естественные киллеры реагируют на митогены Т- и В-клеток [9–11]. Очевидно, механизм усиления цитотоксического эффекта под влиянием бактериальной вакцины несколько отличается от характера действия ЛПС. Можно предположить, что при этом происходит несколько процессов: во-первых, взаимодействие антигенов вакцины с ЛПС-ре-цепторами (CD14), содержащими в популяции МЛПК моноцитов/макрофагов, и последующая инициация секреции регуляторных цитокинов (IL-12, TNF и др.), а во-вторых, активация НК-клеток и Т-лимфоцитов под действием белковых компонентоввакцины [13].

Наличие противоопухолевой активности ВП-4 подтверждает её способность активировать НK-клетки, являющиеся основными эффекторами

Влияние вакцины ВП-4 на рост меланомы В16 у мышей линии с57Bl/6 (n=10)

Таблица 3

№ группы	Схема введения ВП-4	Доза ВП-4, мг/мышь	Размер опухоли меланомы В16 в различные сроки после имплантации, сут
			10		15		22
			Объём опухоли, мм2 (M±m)	ТРО, %	Объём опухоли, мм2 (M±m)	ТРО, %	Объём опухоли, мм2 (M±m)	ТРО, %
1	—	—	1032,0 ± 71,2	–	3184,5 ± 104,3	–	5025,0 ± 173,8	–
2	3-кратно внутрибрюшинно	200 мкг	721,3 ± 81,8	30,1	1904,3 ± 175,6*	40,2	2961,0 ± 175,4*	41,1
3	3-кратно внутрибрюшинно	400 мкг	397,0 ± 53,7*	61,5	1093,6 ± 121,2*	65,6	1543,5 ± 120,2*	69,3

Примечание: * - р<0,01, достоверность различий по сравнению с контролем.

противоопухолевого иммунитета. В настоящее время для повышения эффективности противоопухолевой терапии испытываются различные иммунологические методы воздействия на организм больных. По мнению ряда авторов, рациональное сочетание химиотерапии и иммуномодуляторов микробного происхождения позволяет снижать дозу вводимого цитостатика и повышать эффективность терапии [3, 4].

Сложные механизмы клеточных и молекулярных взаимодействий при введении бактериальных поликомпонентных вакцин изучены в настоящее время недостаточно, что требует продолжения исследований в этом направлении для обоснования целесообразности их использования в практике клинической онкологии в качестве иммуномодулирующих препаратов.