Условия ферментативного гидролиза растительного сырья, предобработанного ультразвуком, в технологии кормового белка

В связи с тем, что лигноцеллюлозные комплексы, в составе которых находятся гемицеллюлоза, целлюлоза и лигнин в растениях, являются малодоступными для ферментативной реакции [9, 11, 12], для их эффективной деструкции в простые сахара, которые необходимы для питания микробного продуцента кормовых дрожжей, необходима предварительная обработка субстрата с целью разрушения кристаллической структуры лигноцеллюлозы [4, 7].

В настоящее время эффективной физикомеханической предобработки лигноцеллюлозного сырья в сахара перед ферментативной обработкой является ультразвуковая дезинтеграция. Ультразвуковое воздействие на лигноцеллюлозное сырье обусловлено упругими колебаниями и волнами с частотой 2023 кГц на пограничный слой и клеточную структуру лигноцеллюлозы, увеличивающее диффузионную проницаемость полимера [3].

Цель исследования - подбор условий проведения ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья, предобработанного ультразвуком, с целью получения простых сахаров в технологии получения кормового белка.

Материалы и методы исследований. Ультразвуковую предобработку целлюлозосодержащего сырья осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе

Soniprep («MSE», UK) с «пальчиковым» преобразователем в интервальном режиме с чередованием импульсов по 30 секунд с частотой 23 кГц и пауз по 20 секунд, с амплитудой колебания звуковода 20 мкм и числом циклов дезинтеграции равное 15. Пробы после воздействия ультразвуком фильтровали через фильтрационную мембрану.

Ферментативный гидролиз предобработанного ультразвуком сырья проводили коммерческим ферментным препаратом ЦеллоЛюкс-F (ЦлА – 2500 ед/гр) в суспензии сырья с гидромодулем 1:30.

В работе использовали целлюлозосодержащее сырье – некондиционное зерно, солому пшеницы и гречихи, предварительно подвергнутые ультразвуковой дезинтеграции c достижением концентрации редуцирующих веществ (РВ) 9,31 – 10,03 г/л [6]. Компоненты реакционной смеси доводили до заданных параметров, соединяли и инкубировали в соответствии с матрицей планирования эксперимента. Для определения продолжительности реакции рассчиты-

, lnfq-Со)

вали константу скорости: гС — по накоплению глюкозы.

В исследовании оптимизацию условий ферментативного гидролиза проводили по методу Бокса-Уилсона с реализацией полного факторного эксперимента (ПФЭ2²) Гаусса-Зейдаля и крутого восхождения. Параметр оптимизации ( Y) - концентрация глюкозы (г/л), факторы варьирования: x 1 – объем рабочего раствора фермента (РРФ), мл; x 2 – рН реакционной смеси, ед; x 3 – продолжительность реакции, мин (см. таблицу 1).

А) Уровень	Фактор
	X 1	X 2	X 3
min x j	2	3,5	20
max xj	20	6	120
x j 0	11	4,75	75
Δ x j	9	1,25	50

Таблица 1. - Распределение уровней факторов ферментативного гидролиза растительного сырья (а) и матрица планирования эксперимента (б)

Б) №	Фактор
	X 0	X 1	X 2	X 3	X 1 X 2	X 1 X 3	X 2 X 3	X 1 X 2 X 3
1	1	-1	-1	-1	1	1	1	1
2	1	1	-1	-1	-1	-1	1	-1
3	1	-1	1	-1	-1	1	-1	-1
4	1	1	1	-1	1	-1	-1	1
5	1	-1	-1	1	1	-1	-1	-1
6	1	1	-1	1	-1	1	-1	1
7	1	-1	1	1	-1	-1	1	1
8	1	1	1	1	1	1	1	-1

Концентрацию глюкозы определяли глюкозоок-сидазным методом с применением коммерческого набора реагентов «Глюкоза ДДС» (АО «ДИАКОН-ДС», Россия) с составом реакционной смеси части нагрузки (дистиллированная вода) и рабочего реагента 1:100. Пробы инкубировали 5 минут при +37^°С. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле: £°^{п —} £™ ^ , где: С оп – концентрация глюкозы, в ммоль/л; С ст – 5,5 ммоль/л глюкозы в стандартном растворе; D оп. – оптическая плотность опытной пробы; D ст. – оптическая плотность стандарта.

Полученный сахарный раствор освобождали от примесей фильтрацией через активированный уголь и с помощью ионообменной смолы, активированной при помощи 0,2М ацетатного буферного раствора (рН

4,0) и 0,2М карбонатного буферного раствора (рН 10,0).

Исследования проводили в 3-кратной повторности. Статистическая обработка данных проведена с использованием программы Microsoft Office Excell 10.

Результаты исследований и их обсуждение. Первоначально скорость ферментативного гидролиза сырья рассчитывали теоретически, на примере гидролиза олигосахаридов с числом мономеров от 2 до 10 при абсолютной активности фермента ЦеллоЛюкс-F (ЦлА – 2500 ед/гр). Зависимость концентрации глюкозы в гидролизате от количества мономеров в молекуле олигосахарида представлена на рисунке 1.

Рис. 1 - Зависимость концентрации глюкозы в гидролизате от количества мономеров в молекуле олигосахарида

Числовые выражения среднего значения и медианы скорости гидролиза совпадают и составили (г/мин): 2,43±0,67 и 2,43 - соответственно; значения первого и третьего квартиля [ Q 1 1,62; Q _З3,24] отличаются от границ доверительного интервала на 7% и 4% - соответственно. Таким образом, 1 мл рабочего раствора фермента ЦеллоЛюкс-F с абсолютной активностью 2500 Ед способен гидролизовать 2,43 г олигосахаридов за 1 минуту. Для гидролиза 1 г субстрата с той же скоростью необходимо 1 мл/2,43 = 0,412 мл стандартного раствора фермента, соответственно.

Рис. 2 - Зависимость концентрации глюкозы (г/л) в ферментализате от объема РРФ и продолжительности гидролиза: а – в зерне пшеницы, б – в соломе пшеницы, в – в соломе гречихи

Показано, что наибольшая концентрация глюкозы определяется в ферментолизате соломы гречихи при добавлении 20 мл РРФ за 90 минут инкубации и составила 12,48 г/л. На соломе пшеницы концентрация глюкозы 10,33 г/л определяется при добавлении 20 мл РРФ за 60 минут инкубации.

В эксперименте с зерном пшеницы не было достигнуто высокого содержания глюкозы в силу того, что ферментативная реакция гидролизата сырья дополнительно должна содержать ферментный препарат, расщепляющий крахмалсодержащие соединения. Биоконверсия зерна пшеницы в легкоусвояемые сбраживаемые сахара с этапом ферментативного гидролиза в технологии, является экономически не выгодным из-за комплекса применяемых не дешевых коммерческих форм ферментных препаратов.

Результаты текущего эксперимента имеют положительную корреляцию с ранее полученными данными по выходу редуцирующих веществ (РВ) при непосредственно выполняемой на стадии предподготовки сырья ультразвуковой дезинтеграции. Содержание РВ

10% рабочий раствор ферментного препарата ЦеллоЛюкс-F (ЦлА - 2500 ед/гр) (РРФ) представляет собой лиофильно высушенной порошок. В исследовании варьировали объемом фермента от 10 до 25 мл и продолжительность реакции от 60 до 120 минут. Гидролиз проводили инкубированием при температуре 60 ° С с начальным значением рН реакционной смеси 5,0±0,05. Зависимость концентрации глюкозы (г/л) в полученном ферментализате в зависимости от объема фермента и продолжительности гидролиза на предоб-работанном ультразвуком исследуемом сырье представлена на рисунке 2.

после дезинтеграции ультразвуком на соломе пшеницы составило 9,99 г/л, на зерне пшеницы - 9,87 г/л, на соломе гречихи - 10,25 г/л [6]. В технологии получения кормового белка, продуцентом которого является дрожжевая клетка, в состав питательной среды для культивирования микроорганизма вводится глюкоза, в силу этого, именно по содержанию глюкозы мы оценивали эффективность ферментативной реакции целлюлозолитическими ферментами препарата.

Для получения максимального выхода глюкозы оптимизировали условия реакции ферментативного гидролиза на основе полученных данных трёхкратной повторности и трёх серий экспериментов. В результате обсчёта данных по методу Бокса-Уилсона с реализацией полного факторного эксперимента (ПФЭ2²) Гаусса-Зейдаля и крутого восхождения была получена математическая модель эксперимента, с уравнением Y = b о + b 2 X 2 , которая адекватно описывает исследуемый процесс и пригодно для оптимизации.

Согласно полученной математической модели, оптимальными условиями ферментативной реакции на соломе злаковых культур являются использование 20 мл РРФ при продолжительности реакции 70 минут. При этом содержание глюкозы в ферментолизате соломы пшеницы – 11,35 г/л; соломы гречихи – 11,54 г/л. Крутое восхождение можно признать эффективным, так как полученный результат на 53% превышает теоретически рассчитанный.

Этой концентрации глюкозы достаточно для культивирования микробного продуцента белка и витаминов - штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365 [5]. Данный штамм микроорганизма характеризуется способностью синтезировать микробиологический белок до 46%, витамин Д 3 720-740 мкг/мл на богатой питательной среде, содержащей наряду с углеводном компонентом и пептон и солодовое сусло. Данная питательная среда в технологии получения кормового белка только увеличивает себестоимость целевого продукта.

При использовании сахарного раствора, полученного нами после ферментативной обработки пре-добработанного ультразвуковой дезинтеграцией соломы злаковых культур, возможна замена дорогостоящего компонента питательной среды выращивания дрожжей на более дешевый природный аналог. При этом компонентный состав полученного нами сахарного раствора имеет дополнительные ростовые компоненты, особо необходимые в технологии выращивания дрожжевой клетки, стимулирующие синтез комплекса витаминов группы В (В1, В2, В3, В5). Тем более, во многих экспериментальных работах, учены- ми показано, что дрожжи хорошо размножаются, и их можно выращивать на отходах сельскохозяйственного и промышленного производства, в том числе на соломе, древесных отходах и т. п. [2].

Так как целью ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья является эффективная деструкции лигноцеллюлозы субстрата в сахара, нами проведена оценка снижения главных компонентов органического состава («сырой» клетчатки и лигнина) исследуемого целлюлозосодержащего сырья и фер-ментолизатов, полученных на их основе, согласно разрабатываемой нами технологии получения кормового белка.

Клетчатка - комплекс химически связанных между собой веществ, придающих жесткость и прочность растительному сырью. Лигнин — это соединение, не относящееся к углеводам, но тесно связанное с клетчаткой. Он является инкрустирующим веществом, обволакивающим целлюлозу. В кормовом продукте клетчатка и лигнин снижает питательность.

В связи с этим, подразумевается в результате биологической деструкции сырья снизить показатели именно «сырой» клетчатки и лигнина, еще и потому, что именно эти органические компоненты имеют в своем составе необходимые нам сахара.

Характеристика органического состава исследуемого целлюлозосодержащего сырья и ферментолиза-тов, полученных на их основе, согласно разрабатываемой нами технологии получения кормового белка, представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Характеристика органического состава исследуемого целлюлозосодержащего сырья и фер- ментолизатов, полученных на их основе по оригинальной методике

Сырье	Содержание, % на сухое вещество
	«сырой» клетчатки		лигнина
	в сырье	в ферментолизате	в сырье	в ферментолизате
солома пшеницы	42,4±0,04	3,2±0,06	1,2±0,07	0,2±0,02
солома гречихи	47,9±0,11	3,5±0,09	2,9±0,04	0,4±0,02

Согласно полученных данных, показано, что в результате оптимизированных при помощи математической модели условий проведения ранее физикомеханических и в данном исследовании биологических методов деструкции целлюлозосодержащего сырья, показатель «сырой» клетчатки в ферментоли-зате соломы пшеницы снизился на 92,45%, лигнина на 83,3%; в ферментолизате соломы гречихи на 92,69% и 86,20% соответственно.

Необходимо обратить внимание на то, что субстрат, имеющий в своем составе большее содержание «сырой» клетчатки и лигнина – солома гречихи, на подобранных условиях деструкции показывает наилучшие показатели. И связано это с тем, что в разрабатываемой нами технологии кормового белка, эффективно проведен надрыв лигноцеллюлозы, подобрана эффективная концентрация фермента.

Таким образом , в результате выполнения данной научной задачи нами показано, что эффективную концентрацию глюкозы возможно достичь при биологической конверсии ферментами целлюлозосодержащего сырья, предобработанного ультразвуком.

Выводы. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза растительного целлюлозосодер- жащего сырья (соломы злаковых культур), предобра-ботанного ультразвуком, в технологии кормового белка с целью получения сахарного раствора являются использование 100 мл гидролизата (после ультразвуковой дезинтеграции) соломы злаковых культур и 20 мл рабочего раствора ферментного препарата Цел-лоЛюкс-F (ЦлА – 2500 ед/гр) в соотношении 5:1 (v/v ) и продолжительностью реакции 70 минут. При этом содержание глюкозы в ферментолизате соломы пшеницы – 11,35 г/л; соломы гречихи – 11,54 г/л соответ-свует потребностям дрожжей при их глубинном культивировании. Крутое восхождение можно признать эффективной, так как полученный результат на 53% превышает теоретически рассчитанный.

В результате оптимизированных при помощи математического моделирования условий проведения ранее физико-механических и в данном исследовании биологических методов деструкции целлюлозосодержащего сырья, показатель «сырой» клетчатки в фер-ментолизате соломы пшеницы снизился на 92,45%, лигнина на 83,3%; в ферментолизате соломы гречихи на 92,69% и 86,20% соответственно. Что говорит, о высокой эффективности разработанной ферментационной системы.

Полученные данные легли в основе технологии получения кормового белка, где сахарный раствор на основе целлюлозосодержащих отходов, служит ком- понентом питательной среды для микробного продуцента кормового белка – дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365.