Условия продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces

Дрожжи, принадлежащие к роду Brettanomyces, признаны контаминантами для вина [1; 2]. В виноделии микроорганизмы появляются после окончания процесса сбраживания сусла, они ответственны за неприятные оттенки в аромате [3; 4]. В промышленном производстве этанола Brettanomyces известны из-за их способности к ферментации сбраживаемых углеводов с образованием уксусной кислоты [5]. Увеличение концентрации уксусной кислоты в среде может оказывать отрицательное влияние на жизнедеятельность Saccharomyces cerevisiae, таким образом уменьшая способность производственной микрофлоры к продуцированию этанола [6], и следовательно, приводит к снижению выхода спирта.

С другой стороны, в пивоварении дрожжи рода Brettanomyces нашли свое применение в производстве таких стилей, как Ламбик и Гёз, синтезируя ароматические компоненты 4-винилгваякол (аромат гвоздики), 4-винилфенол (лекарственные, пластиковые оттенки) и 4-винилкатехол (аромат дыма) [7–9].

Уксусная кислота, полученная в ходе ферментации дрожжей Brettanomyces, участвует в синтезе эфиров, таких, например, как этиловый эфир уксусной кислоты. Показано, что при анаэробной ферментации Brettanomyces производит достаточное количество жирных кислот для снижения рН среды до значения 4,0, которые также участвуют в реакциях этерификации [10]. Некоторые штаммы Brettanomyces могут синтезировать янтарную кислоту в качестве побочного продукта брожения при относительно небольшом количестве кислорода в среде [11].

Применение Brettanomyces в производстве алкогольных напитков широко освещено в литературе, в частности изучалось влияние таких параметров, как рН среды [12], воздействие кислорода [13], влияние концентрации этанола [14]. Влияние температуры на жизнедеятельность дрожжевой клетки наиболее значительно, поскольку температура является одним из важнейших параметров процесса спиртового брожения, который оказывает влияние на кинетику биохимического процесса с изменением метаболизма дрожжевой клетки [6].

Цель работы – оценка количества уксусной кислоты при продуцировании четырьмя различными штаммами Brettanomyces, выбор штамма с точки зрения применения в пивоварении и изучение влияния условий культивирования дрожжей (температура, аэрация и перемешивание) на выход уксусной кислоты.

Материалы и методы

Дрожжи Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces intermedius, Brettanomyces custersianus и Brettanomyces clausenii хранили при температуре 4 °C на среде следующего состава (г/дм ³ ): глюкоза, 20; агар, 20; дрожжевой экстракт, 10.

Для засева культуры состав среды был следующим (г/дм ³ ): глюкоза, 50; KH ₂ PO ₄ , 5; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2; дрожжевой экстракт, 1 и MgSO ₄ 7H ₂ O, 0,4. Начальный рН был скорректирован до 4 с использованием 85 % раствора ортофосфорной кислоты. Затем питательную среду стерилизовали при 120 °C в течение 15 мин.

Засев культуры проводили в колбе вместимостью 500 см ³ с 300 см ³ среды, оборудованной магнитной мешалкой (скорость вращения 250 об./мин). После инокулирования каждую колбу выдерживали при 30 °C в течение 72 ч.

Эксперименты проводились в ферментере вместимостью 15 дм ³ , подключенном к контроллеру для регистрации значений рН и калиброванному ротаметру расхода воздуха. Питательную среду объемом

10 дм ³ стерилизовали в течение 60 мин при 120 °C, добавляли инокулят до достижения 3×10 ⁶ клеток/см ³ . Процесс ферментации проводили при следующих параметрах: температура – 26, 30, 34 °C; скорость вращения мешалки – 250, 350, 450 об./мин; расход воздуха для аэрации среды – 100, 200, 300, 350 дм ³ /ч.

Концентрацию биомассы контролировали с помощью измерений оптической плотности дрожжевой суспензии при 620 нм на спектрофотометре с определением массы клеток после высушивания. Количество мертвых клеток в среде контролировали по стандартной методике ¹ , концентрацию глюкозы – глюкозооксидазным методом. Концентрацию этанола и содержание уксусной кислоты определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектированием ² . Экспериментальная погрешность не превышала 3 % для всех анализируемых соединений.

Для статистической оценки влияния параметров культивирования на количество уксусной кислоты в среде (ПО Design Expert, v. 11.1.0, Stat-Ease Inc.) применяли полный факторный эксперимент 3 ² [15].

Результаты и обсуждение

Выработка уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces

В процессе исследований в среде, содержащей глюкозу, контролировали эффективность продуцирования уксусной кислоты дрожжами Brettanomyces. Процесс проводили в аэробных условиях: расход воздуха 150 дм ³ /ч, температура 30 °С, скорость вращения мешалки 250 об./мин (рис. 1). Конечная концентрация уксусной кислоты была различной в зависимости от применяемого вида: от 1,41 г/дм ³ для B. clausenii до 8,4 г/дм ³ для B. intermedius. В случае участия B. intermedius и B. bruxellensis количество уксусной кислоты увеличилось – концентрация в среде оказалась в четыре раза выше, чем в экспериментах, проводимых с участием B. clausenii и B. сustersianus.

Время, ч

□ Bruxellensis    A Clausenii    О Intermedius ж Custersianus

Рис. 1. Динамика изменения содержания уксусной кислоты в среде Fig. 1. Dynamics of acetic acid content changes in the medium

В табл. 1 приведены кинетические параметры процесса культивирования для каждого штамма дрожжей. Так, B. custersianus и B. clausenii показали самую высокую удельную скорость роста (0,18 и 0,33 ч ^–1 соответственно), но при этом наблюдали более низкое накопление уксусной кислоты (0,06 г/г) по сравнению с двумя другими штаммами (0,16 и 0,14 г/г).

Результаты для B. bruxellensis и B. intermedius показали, что эти штаммы имели самый высокий удельный (0,21 и 0,43 г/(г×ч)) и объемный выход уксусной кислоты (0,05 и 0,06 г/(дм ³ ×ч)). На основании этого B. bruxellensis можно рассматривать как наиболее эффективный штамм для биологического подкисления среды.

Таблица 1. Значения параметров культивирования уксусной кислоты, полученных для различных штаммов дрожжей Brettanomyces

Table 1. Values of acetic acid cultivation parameters obtained for different yeast Brettanomyces strains

Штамм	Окончание культивирования, ч	Удельная скорость роста, µ, ч –1	Выход уксусной к-ты, Y, г/г	Удельный выход уксусной к-ты, Y п , г/(г×ч)	Объемный выход уксусной к-ты, V, г/(дм 3 ×ч)
B. intermedius	151	0,12	0,16	0,21	0,05
B. bruxellensis	102	0,16	0,14	0,43	0,06
B. custersianus	152	0,18	0,06	0,005	0,01
B. clausenii	42	0,33	0,06	0,03	0,03

Влияние расхода воздуха на выход уксусной кислоты и потребление глюкозы

Для исследования влияния концентрации кислорода на выход уксусной кислоты и потребление субстрата дрожжами B. bruxellensis проводили культивирование на среде, содержащей глюкозу, в аэробных условиях (расход воздуха от 100 до 350 дм ³ /ч). Было выявлено, что повышенное содержание кислорода в среде приводит к значительному увеличению выхода уксусной кислоты (табл. 2).

Таблица 2. Значения параметров культивирования, полученных при разных режимах аэрирования для дрожжей Brettanomyces bruxellensis

Table 2. Values of cultivation parameters obtained at different aeration regimes for Brettanomyces bruxellensis yeast

Расход воздуха, дм 3 /ч	Выход уксусной к-ты, Y, г/г	Объемный выход уксусной к-ты, V, г/(дм 3 ×ч)	Выход этанола, %	Потребление глюкозы, %
100	0,030	0,018	3,87	100
200	0,139	0,082	2,50	100
300	0,230	0,134	2,25	100
350	0,284	0,128	2,00	82

Увеличение расхода воздуха отрицательно сказалось на выходе этанола – его содержание снизилось примерно на 45 % при максимальном режиме подачи воздуха. Такой результат характерен для культивирования дрожжей в аэробном режиме (т. н. эффект Кастера) [16].

Субстрат был полностью утилизирован дрожжами при режимах с диапазоном аэрации от 100 до 300 дм ³ /ч. При расходе воздуха 350 дм ³ /ч остаточное количество глюкозы составляло до 18 %. Данный факт можно объяснить тем, что присутствие уксусной кислоты, образующейся при брожении, оказывает ингибирующее действие на процесс ферментации глюкозы дрожжами (в этом случае максимальная концентрация уксусной кислоты составляла 11,2 г/дм ³ ).

Полученные результаты показывают, что оптимальный расход воздуха составляет 300 дм ³ /ч. Выход уксусной кислоты в этом режиме сопоставим с режимом 350 дм ³ /ч (0,23 и 0,28 г/г соответственно), однако при 300 дм ³ /ч наблюдали максимальный объемный выход уксусной кислоты (0,134 г/(дм ³ ×ч)) и полное потребление субстрата.

Влияние температуры и перемешивания на продуцирование уксусной кислоты дрожжами B. bruxellensis

Математические методы планирования эксперимента (центральное композиционное ротатабельное униформпланирование и полный факторный эксперимент 3 ² ) применяли для поиска оптимальных режимов, влияющих на процесс культивирования дрожжей в среде, содержащей глюкозу, при аэрации 300 дм ³ /ч в течение 90 ч.

В качестве основных факторов, влияющих на процесс культивирования, выбраны (табл. 3): x ₁ – температура среды, t, °C; x ₂ – скорость вращения мешалки, об./мин. Выходными параметрами являлись: y ₁ – выход уксусной к-ты, Y, г/г; y ₂ – удельный выход уксусной к-ты, Y _п , г/(г×ч); y ₃ – объемный выход уксусной к-ты, V, г/(дм ³ ×ч). Матрица планирования эксперимента представлена в табл. 3.

Получены уравнения регрессии в кодированных значениях:

Y = 0,194 - 0,009 X 1 - 0,008 X 2 - 0,003 X 1 X 2 - 0,013 X 1² + 0,002 X 22 ;

Y 2 = 0,061 - 0,004 X 1 - 0,033 X 2 + 0,002 X 1 X 2 - 0,031 X 12 + 0,018 X 22 ;

Y 3 = 0,104 - 0,003 X 1 - 0,009 X 2 - 0,001 X 1 X 2 - 0,013 X 12 + 0,003 X ₂ ² .

Таблица 3. Матрица планирования эксперимента Table 3. Experiment planning matrix

Номер эксперимента	x 1 , °C	x 2 , об./мин	y 1 , г/г	y 2 , г/(г×ч)	y 3 , г/(дм 3 ×ч)
1	26	250	0,198	0,072	0,106
2	26	350	0,190	0,041	0,093
3	26	450	0,186	0,024	0,088
4	30	250	0,203	0,143	0,114
5	30	350	0,193	0,046	0,103
6	30	450	0,191	0,030	0,100
7	34	250	0,187	0,060	0,100
8	34	350	0,173	0,032	0,090
9	34	450	0,162	0,021	0,080

Установлено, что оба входных фактора оказывают равностепенное влияние как на выход уксусной кислоты (y 1 ), так и на объемный выход уксусной кислоты (y 3 ) (p < 0,01). В обоих случаях наблюдали обратную зависимость – более высокие значения выходных параметров достигались при более низких значениях температур и скорости вращения мешалки. В случае удельного выхода уксусной кислоты (y ₂ ) существенное влияние оказывала только скорость вращения мешалки (р < 0,01).

Графическая интерпретация уравнений в виде поверхностей отклика приведена на рис. 2. Оптимальные значения выходных параметров были достигнуты при 28 °C и 250 об./мин.

а                                                    б

в

Рис. 2. Поверхности отклика зависимостей температуры среды, x 1 , °C и скорости вращения мешалки, x 2 , об./мин от: а – выхода уксусной кислоты, y 1 , г/г; б – удельного выхода уксусной кислоты, y 2 , г/(г×ч); в – объемного выхода уксусной кислоты, y 3 , г/(дм ³ ×ч)

Fig. 2. Surface response of medium temperature, x 1 , °C and agitator rotation speed, x 2 , rpm from: a – acetic acid yield, y ₁ , g/g; б – the specific yield of acetic acid, y ₂ , g/(g×h), and в – the volumetric yield of acetic acid, y ₃ , g/(dm ³ ×h)

Заключение

В ходе исследования определен оптимальный режим расхода воздуха при полном потреблении глюкозы и достижении максимальных значений объемного – 0,06 г/(дм ³ ×ч) и удельного выхода уксусной кислоты – 0,43 г/(г×ч), равный 300 дм ³ /ч. С помощью статистических методов исследовано влияние температуры и перемешивания среды на выработку уксусной кислоты B. bruxellensis в среде, содержащей глюкозу, при температурных режимах 26, 30, 34 °С и скоростях вращения мешалки 250, 350, 450 об./мин. Оптимальными условиями для максимального объемного выхода уксусной кислоты – 0,114 г/(дм ³ ×ч) выбраны температура среды 28 °C и скорость вращения мешалки 250 об./мин.

В результате анализа определена способность четырех штаммов дрожжей Brettanomyces (intermedius, bruxellensis, custersianus и clausenii) к выработке уксусной кислоты в среде, содержащей глюкозу. Штамм B. bruxellensis признан наиболее эффективным для биологического подкисления среды, в том числе в пивоварении.