Усовершенствование технологии культивирования вирусов парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита для изготовления ассоциированных вакцин КРС

Массовое выращивание вирусов животных в культуре клеток представляет собой центральное звено любого технологического процесса, основанного на использование клеток животных, и прежде всего производство вирусных препаратов [8]. Данная стадия обуславливает массу и качество клеток и, как следствие, технологию получения вирусного сырья. Выбор подхода выращивания вируса в существенной мере связан со способностью клеток размножаться на поверхности плотного субстрата или суспензии [6, 12].

Несмотря на последние достижения в развитии клеточной биотехнологии, получение вирусного сырья на перевиваемых линиях клеток для противовирусных препаратов к настоящему времени испытывает определенные трудности [6]. Широко распространенный способ пристеночного культивирования клеток в матрасах в связи с малой производительностью и большой трудоемкостью малопригоден для промышленного применения [4-7]. На сегодняшний день самым эффективным способом получения в больших объемах вирусной биомассы для изготовления биопрепаратов является использование суспензионной культуры клеток [8]. К высокопродуктивному суспензионному выращиванию приспособлено несколько клеточных линий животных (ВНК-21/13,

ПТП, ППК-66Б), спектр чувствительности которых весьма специфичен, поэтому они не всегда удовлетворяют имеющиеся требования [1, 6].

Последующие исследования были направлены на поиск способов получения вирусной суспензии, выращенных на микроносителях, позволяющие получать вирусную суспензию в короткие сроки, в больших объемах и с высокой инфекционной активностью [13]. Тем не менее, культивирование клеток на микроносителях обусловлено необходимостью использования весьма сложных методов пересева клеток, контроля за их ростом, подготовки носителей и освобождения от последних псевдосуспензии [1]. Все это снижает общую рентабельность производства, несмотря на незначительное повышение конечной плотности популяции клеток. В этом плане наиболее универсальным является роллерный способ выращивания клеток в круговом монослое. Однако он требует детальной отработки режимов выращивания для конкретных клеточных линий с целью обеспечения максимальной реализации их ростового потенциала [1, 3, 4, 6, 9, 11].

Цель исследования – изыскание наиболее эффективной технологии выращивания культур клеток для получения биомассы вирусов ПГ-3 и ИРТ с высокой инфекционной активностью.

Материал и методы исследований. Для создания ассоциированных вакцин, в состав которых входят антигены ПГ-3 и ИРТ КРС, требовалось, в первую очередь, изучить чувствительность первичных и перевиваемых линий культур клеток к штаммам «ТК-А (ВИЭВ)-В2» вируса ИРТ и «ПТК-45/86» вируса ПГ-3, полученных из государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В предварительных опытах по выбору культуры клеток было установлено, что наиболее перспективными для репродукции указанных вакцинных штаммов вирусов являются перевиваемые клетки почки (МДВК) и трахеи (ТР) эмбриона коровы.

В экспериментах по отработке оптимального метода выращивания вирусов ИРТ и ПГ-3 КРС исследованы следующие параметры: время формирования получаемого монослоя, начальная посевная концентрация клеток, доза заражения, сроки проявления максимального цитопатического действия, состав питательной среды. Репродукцию штаммов вирусов проводили с применением перевиваемых линий культур клеток МДВК и ТР стационарным и роллерным методами. При этом осуществляли учет коэффициента заполнения роллерных бутылей, скорости их вращения, рН среды и температуры культивирования, продолжительности выращивания, количества пассажей клеток и вирусов.

При выращивании культур клеток животных в качестве ростовой среды применяли следующие питательные среды: ГЛА, 199, Игла MEM с внесением 1 % L-глютамина, 10 % сыворотки крови КРС и гентамицина в концентрации 50 мкг/мл. Для поддержания культур клеток после заражения использовали вышеуказанные среды без сыворотки. Для культивирования клеток и вирусов использовали матрасы объемом 1500 мл (стационарное выращивание) и бутыли объемом 2500 мл «типа четверть» (роллерное культивирование на промышленной установке). После каждого опыта инфекционную активность вирусной биомассы определяли методом микротитрации на 96-луночных планшетах, культуры клеток инкубировали в инкубаторе во влажной атмосфере с концентрацией СО 2 5 % в течение 48-96 ч (в зависимости от репродукции вирусов). Инфекционный титр вирусов рассчитывали методом Рида и Менча. Контроль культуры клеток и штаммов вирусов ИРТ и ПГ-3 на возможную контаминацию микоплазмами осуществляли высевом их на бульон, используя триптический перевар сердца КРС.

Результат исследований . В таблице 1 представлены результаты исследований по установлению оптимальных условий получения высокоактивной биомассы штаммов вирусов ИРТ и ПГ-3 КРС с целью изготовления ассоциированной вакцины.

Таблица 1 – Параметры, влияющие на накопление вирусов, при различных способах культивирования

Максимальный титр инфекционной активности исследуемых вирусов достигался методом роллерного культивирования и для вируса ПГ-3 составил 7,9-8,3 lg ТЦД50/мл и для вируса ИРТ – 7,2-8,5 lg ТЦД50/мл (Рисунок 1). При этом вирусы репродуцировали с коэффициентом заполнения сосудов 0,170,19 и скорости их вращения 10-11 об/ч. Для инфицирования клеточного монослоя использовали вирус ПГ-3 в дозе 0,6±0,2 ТЦД50/мл на клетку и вирус ИРТ - 0,4±0,1 ТЦД50/мл на клетку.

Рисунок 1 – Инфекционная активность штаммов вирусов ПГ-3 и ИРТ КРС при различных способах выращивания

Рисунок 2 – Влияние состава питательной среды на репродукцию штаммов вирусов ПГ-3 и ИРТ КРС

Основными параметрами, которые определяют уровень накопления вирусов в монослое клеток, являются концентрация водородных ионов (рН) и температура культивирования. Наши исследования показали хорошую репродукцию вирусов ПГ-3 и ИРТ при температуре 37±0,5 ˚С и рН 7,2±0,2. При более низких или высоких значениях рН (5,0 и 9,0) и температуры (35 и 39 ˚С) активность вирусов была ниже на 0,3-1,24 lg ТЦД 50 /мл.

На жизнеспособность клеток линии ТР и выращивание в ней вируса ПГ-3 существенное влияние оказывал состав питательной среды (Рисунок 2).

Применение поддерживающей питательной среды, состоящей из 10 % среды 199,40 % Игла МЭМ и 50 % ГЛА, в культуре клеток линии ТР увеличивало урожайность вируса ПГ-3 до 8,0-8,3 lg ТЦД 50/мл, в то время как поддерживающая среда Игла МЭМ с добавлением 1% глутамина в культуре клеток МДВК не обеспечивало накопление титра вируса ПГ-3 на достаточно высоком уровне. При репродукции вируса ИРТ на культуре клеток МДВК с поддерживающей средой Игла МЭМ и добавлением 1 % глутамина наблюдали повышение инфекционного титра до 8,08,5 lg ТЦД 50/мл. Следует отметить, что замена вышеуказанной среды на смешанную среду (50 % ГЛА, 40 % Игла МЭМ и 10 % среды 199) снижала инфекционную активность на 1,35±0,15 lg ТЦД 50/мл.

Следует отметить, что присутствие в питательных средах смеси антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) в рекомендуемой дозе предотвращало контаминацию культур клеток бактериальной микрофлоры и не оказывало влияния на конечный титр вирусов.

Заключение. Результаты изучения условий роллерного культивирования перевиваемых линий клеток МДВК и ТР, которые отобраны по признакам высокой чувствительности и репродуцирующей способности к штаммам вирусам ИРТ и ПГ-3, позволяют получить высокоактивные антигены для возможности конструирования ассоциированной вакцины.