Усовершенствованная методика определения содержания глюко-зинолатов в семенах масличных культур семейства Brassicaceae

Введение . Полномасштабная селекционная работа с озимыми и яровыми формами рапса и сурепицы была начата во ВНИИМК в 1983 г. и направлена на создание безэруковых и низкоглюкозинолат-ных сортов («тип 00»). До этого времени в масле всех районированных и возделываемых отечественных сортов этих культур содержалось свыше 43 % эруковой кислоты, а в обезжиренных семенах – от 90 до 140 мкмоль/г глюкозинолатов. Масло, получаемое из семян таких сортов, использовалось на технические цели, а шрот – в ограниченном количестве на корм скоту. Снижение содержания глюкозинолатов в семенах рапса почти в 2 раза (с 45 до 22– 26 мкмоль/г семян) было достигнуто селекционным путем в период с 1984 по 1988 гг. В это время были созданы первые отечественные сорта рапса ярового типа «00» Эввин, Шпат и Ярвэлон методом многократного индивидуального отбора с оценкой по потомству из гибридных комбинаций и обязательным контролем общего содержания глюкозинолатов в семенах [1].

В процессе продолжительной совместной работы селекционеров и биохимиков были получены биотипы рапса и сурепицы, содержащие менее 8 мкмоль/г глю-козинолатов в семенах. Успешное выполнение поставленных селекционных задач по снижению этих серосодержащих веществ было обусловлено разработкой и внедрением Н.С. Осик эффективной методики определения общего содержания глюкозинолатов в семенах капустных культур [2].

Данная методика явилась модификацией метода Тисса (W. Thies, Institute of Agronomy and Plant Breeding, University Göttingen, Germany, 1982 г.), в основе которого лежало образование окрашенного комплекса при взаимодействии глюкози-нолатов с тетрахлорпалладатом (II) натрия [3]. Параллельно Г.Т. Демьянчуком с коллективом проводилась аналогичная работа. И в 1988 г. были выпущены методические указания по «Оценке селекционного материала рапса и сурепицы на содержание эруковой кислоты и глюкозино-латов» [4]. Методические указания Г.Т. Демьянчука являлись долгое время единственным официальным нормативным документом в Российской Федерации по определению глюкозинолатов в семенах рапса и сурепицы.

Достоинством методики, разработанной во ВНИИМК, является более высокая производительность в сравнении с методикой Демьянчука, а также наличие разработанной калибровочной таблицы показаний оптической плотности растворов D с известным содержанием глюкозинолатов, выраженных в процентах или мкмоль на грамм семян [2]. С другой стороны, это достоинство является и некоторым неудобством в современном способе заполнения электронного журнала. Потому что градуировочная таблица, выполненная с шагом в 0,01 % содержания глюкозинолатов от величины оптической плотности испытуемого раствора, достаточно объемная и занимает более трех страниц табличного текста.

С 2016 г. действует новый нормативный документ ГОСТ ISO 9167-1-2015. «Рапс. Определение содержания глюкози-нолатов. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии» [5], который характеризуется довольно сложным по ис- полнению и большим набором импортных, узкоспециализированных химических реактивов, а также непредсказуемой логистикой их приобретения.

Цель наших исследований – сравнительный анализ существующих методов определения содержания глюкозинолатов в семенах и поиск наиболее простой, точной и производительной методики, позволяющей вести эффективно селекционную работу с масличными культурами семейства Brassicaсeаe.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории биохимии на образцах рапса, выращенных в 2022–2024 гг. в условиях центральной зоны Краснодарского края.

В качестве основы для усовершенствования определения глюкозинолатов в семенах рапса была использована методика, разработанная Н.С. Осик, выполняемая на фотоколориметре КФК-2. Методика заключается в колориметрическом определении палладиевым реактивом алкенил-глюкозинолатов (глюконапита, глюкоб-рассиканапина, прогойтрина) содержащихся в водном экстракте семян [2].

Для расчета доверительного интервала использовали метод статистического анализа ряда данных.

Результаты и обсуждение. В последние годы было предпринято много усилий по выявлению ошибок и причин повышения погрешности определения общего содержания глюкозинолатов в семенах рапса и сурепицы. Был проведен тщательный анализ приготовления применяемых растворов, способы перемешивания и использования различных устройств. Установлено, что применение ультразвуковой бани для интенсивного перемешивания негативно влияет на образование окрашенного комплекса глюкозинолатов с тет-рахлорпалладатом (II) натрия. Так как это количественный анализ, точность и своевременность проведения всех этапов манипуляций позволяет снизить погрешность определения до 1–2 мкмоль/г семян.

Ниже представлена усовершенствованная методика общего определения глюко-зинолатов в семенах масличных культур семейства Brassicaсeаe с использованием современных приборов: электронного спектрофотометра В-1200 и вортекса (устройство для быстрого и эффективного смешивания/перемешивания компонентов маловязких жидкостей за счет создания сильного вихревого движения смеси в емкости).

Для анализа берут 3–5 г очищенных семян рапса с влажностью не более 7 %, тщательно измельчают на мельнице или кофемолке дважды: первый раз 10 с и перемешивают измельченную массу шпателем, второй – немного дольше, в зависимости от масличности и влажности. Пересыпают в фарфоровую ступку и равномерно распределяют полученную массу. Взвешивают навеску 200 мг на торсионных весах и переносят в пробирку с пробкой с меткой на 5 мл, в пробирки добавляют по 0,3 мл 80 % этанола. Металлический штатив с пробирками и пробками к ним устанавливают в ультротермостат на 5 мин при температуре 90 °С для инактивации фермента мирозиназы. Достают штатив из термостата, приподнимая пробку, приливают в каждую пробирку пипеточным автоматическим дозатором 3 мл кипящей воды. В это время термостат закрывают крышкой и переводят регулятор температуры на 95 °С. Затем снова устанавливают штатив в термостат на 20 мин. Пробирки охлаждают в емкости с водой до комнатной температуры (10 мин) и в каждую добавляют по 100 мкл 30 % водного раствора сернокислого цинка пипеточным автоматическим дозатором. Тщательно перемешивают каждую пробирку, используя пробирочный встряхиватель – вортекс. После этого добавляют по 100 мкл 15%-ного раствора желтой кровяной соли (гексацианоферрат (II) калия K 4 [Fe(CN) 6 ]) и также перемешивают. Эти манипуляции проводят для освобождения экстракта от белковых и цветообразующих компонентов. Затем доводят объем раствора до 5 мл дистиллированной водой до метки на пробирке.

Содержимое снова перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Из полученного фильтрата отбирают дозатором по 200 мкл в две пробирки каждый образец, после чего во все пробирки приливают по 1,8 мл 0,02 М раствора тетрахлор-палладата (II) натрия дозатором переменного объема. Также готовят пробирку холостой пробы. Для этого берут 200 мкл дистиллированной воды и 1,8 мл 0,02 М раствора тетрахлорпалладата (II) натрия. Полученный раствор перемешивают и инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре (25 °С). Время отмечают, когда начинают добавлять раствор тетрахлорпалладата (II) натрия.

Оптическую плотность окрашенного комплекса измеряют на спектрофотометре В-1200 при 440 нм в кювете толщиной 3 мм и общим объемом 2 мл против холостой пробы. Перед анализом на спектрофотометре кюветы обрабатывают хромовой смесью (смесь концентрированной серной кислоты и дихромата калия) в течение 5 мин. Полученные данные параллельных испытаний оптической плотности растворов D проверяют правильность выполнения анализа, если разница превышает 8 %, то данный образец повторяют, если меньше – вычисляют среднее значение. Расчет общего содержания глюкозинолатов в семенах рапса и сурепицы ведут по калибровочной таблице показаний оптической плотности растворов D с известным содержанием глюкозинолатов, выраженных в процентах или мкмоль на грамм семян.

Приготовление растворов. Водный раствор тетрахлорпалладата (II) натрия готовят непосредственно перед измерением массовой доли глюкозинолатов в семенах. На аналитических весах отвешивают 0,0354 г и растворяют в стаканчике с 2 мл насыщенного раствора NaCl и с 2 мл горячей дистиллированной воды на водяной бане при 90 °С, постоянно помешивая глазной палочкой до полного растворения. Раствор должен быть прозрачным. Если не становится прозрачным, то необходимо добавить немного горячей дистиллированной воды. Прозрачный раствор переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу с воронкой по палочке очень аккуратно. Затем ополаскивают палочку и стаканчик, выливая все в колбу, и доводят до метки.

Для приготовления насыщенного раствора NaCl берут навеску 35 г и растворяют ее в 100 мл дистиллированной воды.

30%-ный водный раствор сульфата цинка (ZnSO 4 *7 H 2 O): 30 г сульфата цинка растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора водой до 100 мл.

10%-ный водный раствор желтой кровяной соли (железистосинеродистого калия): 15 г [K 4 Fe(CN) 6 ]*3H 2 O растворяют с небольшим подогревом с дистиллированной водой и доводят объем до 100 мл.

По калибровочной таблице [2] нами получено уравнение расчета общего содержания глюкозинолатов в семенах в зависимости от оптической плотности раствора D, представленное на рисунке.

Оптическая плотность раствора D

Рисунок – Калибровочный график зависимости содержания глюкозинолатов в семенах рапса от оптической плотности раствора D

Полученное уравнение: y = 199,5x - 1,77, позволяет использовать электронные таблицы и ввод значений аргумента (оптической плотности раствора) в ячейку. Таким образом, будет автоматически рассчитываться значение ординаты.

Для подтверждения качества предлагаемой методики были взяты данные значений содержания глюкозинолатов в контрольном образце из журнала регистрации массовых анализов по рапсу. В июне 2023 г.

контрольным образцом стал перспективный номер (новый сорт озимого рапса Оливин), 300 г семян которого были подготовлены для исследований повторяемости и влияния несистематических факторов на результаты. За прошедшее время было проанализировано 1300 образцов, из которых контрольный образец оценили в 52 повторениях. Статистический анализ данных ряда значений содержания глюко-зинолатов в семенах сорта Оливин представлен в таблице 1.

Таблица 1

Параметры статистического анализа данных ряда значений содержания глюкозинолатов в семенах рапса сорта Оливин

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Параметры	Значение содержания глюкозинолатов в семенах рапса, мкмоль/г
Среднее значение	14,2
Мин	13,7
Мах	15,1
Размах варьирования	1,4
Стандартное отклонение	0,27
Величина -n	52
Доверительный интервал	0,07

Среднее значение искомого показателя составило 14,2 мкмоль/г. Диапазон изменчивости содержания глюкозинолатов в семенах сорта Оливин был от 13,7 до 15,1 мкмоль/г с размахом варьирования 1,4 мкмоль/г. Наблюдается небольшая асимметрия представленных данных с модой этого ряда – 14,3 мкмоль/г.

Погрешность определения содержания глюкозинолатов в семенах рапса составила менее 1 мкмоль/г при стандартном отклонении в 0,27.

Для подтверждения работоспособности усовершенствованной нами методики были проведены межлабораторные исследования на трех образцах рапса с различным содержанием искомого показателя. Часть исследований выполнили сотрудники испытательной лаборатории ФГБУ

«Центр оценки качества зерна» согласно методическим указаниям 1988 г. Г.Т. Демь-янчука [4].

Полученные результаты испытаний были предоставлены для сравнительного анализа подобных методик, статистический анализ данных представлен в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительный анализ подобных методик определения и параметры статистического анализа данных ряда значений содержания глюкозинолатов в семенах рапса трех образцов

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Параметры	Содержание глюкозинолатов в семенах рапса, мкмоль/г
	№ 254	№ 328	№ 294
Среднее значение, по методике ВНИИМК	20,5	49,5	75,4
Среднее значение, по методике Демьянчука Г.Т.	21,7	48,3	72,1
Мин	20,4	46,8	70,8
Мах	22,8	50,4	73,2
Размах варьирования	2,4	3,6	2,4
Стандартное отклонение	0,71	1,08	0,85
Величина -n	22	22	22
Доверительный интервал	0,30	0,45	0,36

Анализ полученных данных показал, что разница средних значений содержания глюкозинолатов образца № 254 составила 1,2 единицы при величине признака 20,5 мкмоль/г, у № 328 – 0,8 при значении 49,5 мкмоль/г, а у образца № 294 получили 3,3 при 75,4 мкмоль/г, такие различия допустимы для межлабораторных испытаний. С другой стороны, представленные статистические данные ряда значений содержания глюкозинолатов, полученные по методике Г.Т. Демьянчука, имеют несколько большее стандартное отклонение и доверительный интервал, но не превышают допустимой погрешности.

Необходимо отметить, что эти методики по последовательности и использованию химических реактивов идентичны, а различаются по величине навески, концентрации некоторых реактивов, значению оптической плотности комплексного раствора фильтрата глюкозинолатов с тет-рахлорпалладатом ( II ) натрия и способом расчета концентрации глюкозинолатов в семенах рапса. Различия незначительны по величине средних значений, а усовершенствованная методика ВНИИМК в два раза производительнее и более технологичная по выполнению испытания и использованию химической посуды. Однако исследования были выполнены по расчетным методикам.

Для подтверждения точности разрабатываемой методики были проведены межлабораторные испытания в сравнении с методом ВЭЖХ [5]. Данный метод предполагает экстракцию семян рапса горячим метанолом с использованием внутреннего стандарта, проведение десульфатирования и элюирования десульфоглюкозинолатов и дальнейшее разделения на ВЭЖХ колонке с градиентом элюирования вода/ацетонитрил. Регистрацию отдельных форм глюкозинолатов оценивают с помощью диодно-матричного детектора (ДАД) с идентификацией индивидуальных глюкозинолатов на масс-детекторе. Расчет общего содержания глюкозинола-тов в семенах рапса производили по сумме площадей всех глюкозинолатов и коэффициенту отклика детектора индивидуальных форм.

Часть исследований выполнили сотрудники из «Учебно-научного центра коллективного пользования «Сервисная лаборатория комплексного анализа химических соединений» РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева согласно ГОСТ ISO 91671-2015. «РАПС. Определение содержания глюкозинолатов. Метод ВЭЖХ» [5]. Сравнительный анализ различных методов проведенных испытаний восьми образцов рапса представлен в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительный анализ различных методов (спектрофотометрический и ВЭЖХ) проведенных испытаний средних значений восьми образцов рапса

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

	Значение содержания глюкозинолатов в семенах рапса, мкмоль/г на а.с.в.
№ образца	№ 1	№ 3	№ 4	№ 5	№ 6	№ 9	№10	№13
Методика ВНИИМК	8,5	27,1	33,4	46,2	49,4	16,3	30,3	92,1
Метод ВЭЖХ	7,6	25,7	31,6	47,0	49,6	15,1	26,5	87,0
Разница	0,9	1,4	1,8	-0,8	-0,2	1,2	3,8	4,6

87 мкмоль/г, а требование в ранге «воспро-

Полученные сравнительные данные по- казали, что различия между стандартным современным арбитражным методом и представленной методикой соответствуют в ранге прецизионности результатов межлабораторных испытаний по повторяемости. Значения погрешности определения должны быть не более 2 мкмоль/г при содержании глюкозинолатов менее 20 мкмоль/г и не более 4 мкмоль/г при содержании глю-козинолатов в диапазоне от 20 до 35 мкмоль/г. Исключением является образец № 13, со- изводимости» допускает погрешность не более 8 мкмоль/г.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ существующих методов определения содержания глюкозинолатов в семенах рапса показал сопоставимые значения результатов испытаний, различия которых были в пределах допустимых погрешностей.

Заключение. Представленная методика определения общего содержания держания глюкозинолатов составило

глюкозинолатов в семенах показала адекватную повторяемость на спектрофотометре В-1200 и встряхивателе типа вор-текс. Получено уравнение расчета содержания глюкозинолатов в зависимости от оптической плотности комплексного раствора глюкозинолатов с тетрахлорпалла-датом (II) натрия в мкмоль/г семян.

Усовершенствованная методика является наиболее простой, достаточно точной и производительной, что позволяет эффективно вести селекционную работу с масличными культурами семейства Brassi-caceae.