Уточнение видового состава грибов рода fusarium на подсолнечнике

Введение . Грибы рода Fusarium (теле-оморфа – Gibberella ) распространены по всему миру. Представители рода являются возбудителями фузариозов у сельскохозяйственных культур, фузариотоксико-зов у животных и человека. Большинство видов рода Fusarium – возбудители болезней растений. В поражении растений участвует комплекс фузариевых грибов, различающихся по биологическим свойствам и адаптированных к определенным условиям биоценоза [1; 2].

Для разработки мер по ограничению численности и вредоносности этого патогена необходимо достоверно знать видовой состав грибов рода Fusarium в данной местности, на определенном круге растений-хозяев. Однако обилие морфологических, культуральных признаков, сильная изменчивость, отсутствие единой классификации этого рода крайне затрудняет определение видов и приводит к несогласованности результатов исследований. Так, по видовому составу грибов рода Fusarium на растениях подсолнечника опубликовано несколько работ, в которых число видов варьирует от 7 до 20 [3; 4; 5; 6; 7; 8].

С момента объединения в 1809 г. немецким микологом Х.Ф. Линком грибов, имеющих веретеновидно-серповидную форму, в род Fusarium опубликовано несколько таксономических систем, которые отличаются разными подходами к идентификации видов. До середины 30-х годов ХХ столетия в роде насчитывалось более 1000 видов. В 1935 г. немецкие микологи Волленвебер и Рейнкинг

(Wollenweber, Reinking, 1935) систематизировали существующие виды и опубликовали первую таксономическую систему, которая стала основой для современной таксономии рода Fusarium. Согласно их классификации род состоит из 65 видов, 55 разновидностей и 22 форм, разделенных на 16 секций. Американская система В.К. Снайдера и Г.Н. Хансена (Snyder, Hansen, 1945) построена на объединении нескольких секций в один вид и формы, патогенные для растений, и представлена 9 видами. Например, по их системе вид Fusarium oxysporum имел 25 специализированных форм. Египетские ученые С.М. Мессиан и Р. Кассини (Messiaen, Cassini, 1968) модифицировали американскую систему и ввели ботанические разновидности вместо культиваров, т.е. F. roseum var. culmorum , F. roseum var. graminearum . Ближе к системе Волленве-бера и Рейнкинга канадская система В.Л. Гордона (W.L. Gordon, 1952). В ней род Fusarium представлен 26 видами, на основании ревизии секций Lateritium, Lise-olla, Elegans, Martiella . Английский миколог К. Бус (Booth, 1971), отдавая предпочтение строению конидиогенных клеток, модифицировал канадскую таксономию. Род Fusarium в системе К. Буса представлен 12 секциями, 44 видами и 7 разновидностями. В настоящее время в мире наиболее пригодными для практической идентификации являются таксономические системы, разработанные американскими исследователями П.Е. Нельсоном с соавторами (Nelson et al., 1983) и немецкими микологами В. Герлахом и Х. Ниренберг (Gerlach, Nirenberg, 1982). В них наиболее полно охарактеризованы все морфолого-культуральные признаки рода Fusarium . И, несмотря на то, что определители П.Е. Нельсона с соавторами и В. Герлаха и Х. Ниренберг различаются по количеству видов (30 и 73 вида соответственно), они имеют сходные по многим показателям характеристики самих видов [9; 10; 11].

На территории России используется система, предложенная В.И. Билай (1955, 1977), в которой описан 31 вид. Однако большинство специалистов не согласны с описанием, номенклатурой и положением отдельных видов. Со времени ее опубликования получены новые знания об изменчивости культуральных и морфологических признаков, о строении органов конидиального спороношения, у 37–50 % (по разным таксономическим системам) обнаружены половые стадии [9; 12; 13].

Универсально приемлемого принципа классификации грибов рода Fusarium до сих пор нет. В 2008 г. Н.П. Шипилова, В.Г. Иващенко представили работу по систематике и диагностике грибов рода Fusarium , которая облегчает определение видовой принадлежности и соответствует современной номенклатуре и таксономии [14].

Основанием для уточнения видового состава послужило отсутствие в таксономической системе В.И. Билай некоторых видов, несовпадение видовых названий, а также положение видов в секциях и наличие самих секций, принятых в настоящее время в других странах мира. Кроме того, описания видов в системе В.И. Билай часто отличаются от общепринятых, так как в ней отсутствуют некоторые морфологические признаки (например, характеристика конидиогенных клеток), которые лежат в основе современной идентификации видов. Это приводит к путанице при анализе отечественной и иностранной литературы, неточностям при определении видового состава, что значительно усложняет обобщение результатов мониторинга видового состава в регионах и крайне затрудняет практическую оценку для проведения успешной селекции подсолнечника на устойчивость к фузариозу.

Материалы и методы . С целью уточнения видового состава грибов рода Fusarium на подсолнечнике использовали свыше 2000 пораженных фузариозом образцов подсолнечника, отобранных во время маршрутных обследований семенных и производственных посевов в 2009– 2012 гг.

Выделение возбудителя в чистую культуру, изучение его морфологических, культуральных свойств осуществляли по методикам Наумова [15], Райлло [1], Би-лай [16; 17]. Диагностику и идентификацию проводили по классификациям Шипиловой, Иващенко [14], Нельсона с соавторами [11], Герлаха и Ниренберг [10]. Выделение и культивирование чистых культур гриба осуществляли на картофельном, сусловом и голодном агарах.

При идентификации грибов рода Fusarium учитывали следующие характеристики:

• а)    микроморфологические признаки (тип и морфология конидий; строение органов конидиального спороношения, наличие или отсутствие хламидоспор); из элементов морфологии макроконидий определяли: характер изогнутости, форму апикальной клетки, наличие ножки в основании базальной клетки, количество перегородок. Учитывали наличие микроконидий, форму и способ их образования;

• б)    макроморфологические признаки (структура и развитие воздушного мицелия, цвет мицелиия и реверса, скорость роста колоний, наличие или отсутствие склероциев).

Пигментацию и окраску воздушного мицелия устанавливали на 15-й день инкубирования гриба при 24 °С на КГА и СА [1; 14; 15; 16; 17] (рис.1).

б

а                    б

Рисунок 1 – Пигментация культуры гриба на рисе (а) и картофельном агаре (б).

Результаты и обсуждение. С 1999 по 2008 гг. идентификацию изолятов, выделенных с пораженных фузариозом органов растений подсолнечника, осуществляли по методике и определителю В.И. Билай. По полученным данным, комплекс патогенов, вызывающий фузариоз подсолнечника, включал 20 видов и разновидностей, относящихся к шести секциям рода Fusarium . По результатам микроскопического анализа доминирующим видом, паразитирующим на подсолнечнике, являлся вид F. oxysporum (Schlecht.) emend Snyd. et Hans. и его разновидность F. oxysporum v. orthoceras (App. et Wr.) Bilai из секции Elegans . Частота встречаемости в исследуемых образцах – 39,8 %. При этом преобладала разновидность F. oxysporum v. оrthoceras – 31,0 %, которая не упоминается ни в одной другой таксономической системе. К секции Elegans относился вид F. moniliforme Sheld . с разновидностью F. moniliforme v. lactis (Pir. et Rib.) Bilai, которые выделялись в основном из семядолей и корзинок. Распространенность составляла 1,2 и 2,9 % соответственно. В настоящее время у вида F. moniliforme Sheld. изменено видовое название и положение в таксономической системе. В таксономических системах П.Е. Нельсона с соавторами (Nelson et al., 1983), В. Герлаха и Х. Ниренберг (Gerlach, Nirenberg, 1982) вид F. monili-forme Sheld . объединен с разновидностью F. moniliforme v. lactis (Pir. et Rib.) Bilai и отнесен в секцию Liseola . В определителях В.И. Билай эта секция отсутствует. Кроме того, в 1998 г. на VIII Международном совещании по грибам рода Fusarium , вид F . moniliforme Sheld. переименован в F. verticillioides ( Sacc.) Nirenb. По нашим данным, секцию Sporotrichiella на подсолнечнике представляли две разновидности F. sporotrichiella v. poae (Pk.) Wr. emend Bilai и F. sporotrichiella v. spo-rotrichioides (Sherb.) Bilai с частотой встречаемости 12,7 и 9,7 % соответственно. В современных определителях они рассматриваются как отдельные виды.

Восемь видов, выделенные из различных частей растений подсолнечника, относились к секции Discolor : F. lateritium Neеs, F. gibbosum App. еt Wr. emend Bilai, F. gibbosum v. bullatum (Sherb.) Bilai, F. gib-bosum v. acuminatum (Ell. et Ev) Bilai, F. heterosporum Neеs, F. sambucinum v. os-sicolum (Berk. et Curt) Bilai, F. sambucinum v. sublunatum (Rg.) Bilai, F. culmorum (W.G. Smith) Sacc. Распространенность их колебалась от 0,2 до 6,5 %. В настоящее время у видов F. gibbosum v. acuminatum , F. gibbosum App. еt Wr. emend Bilai изменены видовые названия и они отнесены в секцию Gibbosum , которая отсутствует в системе В.И. Билай. Вид F. semitectum Berk. et Rav. с разновидностью F. semitectum v. majus Wr . в определителе В.И. Би-лай отнесен к секции Roseum . Распространенность их не превышала 3,5 %. В 1983 г. П.Е. Нельсон с соавторами объединили F. semitectum и его разновидность в один вид и перенесли в секцию Arthrosporiella. По данным микологического анализа, секцию Martiella представляли: F. solani (Mart.) App. et Wr., разновидность F. solani v. argillaceum (Fr.) Bilai и F. javanicum Koord. Эти виды в основном выделялись из корней с частотой встречаемости 5,3; 1,3; 0,7 % соответственно. В последнее время секция Martiella в публикациях рассматривается как Martiella complex или Nectria haema-tococca complex, в которую входит комплекс видов F. solani .

Таким образом, полученные нами данные по номенклатуре видов и их положению в секциях по системе В.И. Билай не совсем согласуются с информацией по систематике грибов рода Fusarium, опубликованной в последние годы.

С 2009 г. определение видовой принадлежности грибов рода Fusarium осуществляли по диагностическим признакам и номенклатуре, принятой в настоящее время. По результатам идентификации видов, выделенных с пораженных фузариозом органов растений подсолнечника, патосистема гриба состоит из 12

видов, относящихся к восьми секциям рода Fusarium (табл. 1).

Таблица 1

Распространенность видов грибов рода Fusarium, выделенных из пораженных растений подсолнечника

ВНИИМК, 2009–2012 гг.

Секция	Вид	Частота встречаемости, %
Lateritium	F. lateritium Neеs.	0,6
Gibbosum	F. equiseti (Corda) Sacc.	1,9
Discolor	F. heterosporum Nees.ex Fr.	1,0
	F. sambucinum Fuckel.	4,5
	F. culmorum (W.G. Sm.) Sacc.	4,0
Elegans	F. oxysporum (Schlecht.) emend Snyd. & Hans.	31,1
Liseola	F. verticillioides ( Sacc.) Nirenb.	7,7
	F . proliferatum (Matsush.) Nirenb. (1976)	4,1
Arthrosporiella	F. semitectum Berk.& Rav.in Berk.	3,5
Sporotrichiella	F. poae (Peck) Wollenw.	18,5
	F. sporotrichioides Sherb.	8,5
Martiella	F. solani (Mart.) Saсс.	14,6

По нашим новым данным, одним из основных возбудителей, вызывающих корневую гниль и фузариозное увядание, является вид F. oxysporum (Schlecht.) emend Shyd. & Hans. Частота встречаемости в исследуемых образцах – 31,1 %. Согласно современным представлениям (Гагкаева, Левитин, 2005) в секцию Ele-gans входит группа видов F. oxysporum . Между изолятами имеются значительные различия, как по окраске воздушного мицелия, так и по пигментации реверса. Для них характерно обильное формирование цилиндрических, эллипсоидных, овальных микроконидий в ложных головках. Макроконидии слегка изогнутые или почти прямые, с постепенно и равномерно суживающейся апикальной клеткой, иногда слегка загнутой, обычно с тремя перегородками, иногда больше. Макроконидии образуются в воздушном мицелии в спородохиях или пионнотах (рис. 2).

По разным системам секция Liseola представлена различным количеством видов. На подсолнечнике мы выделили два вида: F. verticillioides ( Sacc.) Nirenb. и

F. proliferatum (Matsush.) Nirenb., частота встречаемости 7,7 и 4,1 % соответственно. Большинство изолятов этих видов было выделено из семядолей, корзинок и семян. Основной диагностический признак вида F. verticillioides – это образование микроконидий в длинных, прямых или извилистых цепочках на монофиали-дах (рис. 3). Иногда микроконидии собраны в ложные головки.

Рисунок 2 – F. oxysporum : а) мицелий с органами спороношения; б) конидии

а

б

Рисунок 3 – F. verticillioides : а) цепочки микроконидий; б) монофиалиды

Микроконидии образуются обильно на 2–3-й день. Макроконидии не обильные, в некоторых культурах образуются редко. Хламидоспоры отсутствуют. Культуры этого вида не продуцируют красный пигмент.

Вид F. proliferatum отличается от вида F. verticillioides формированием микроконидий в коротких цепочках и образованием разветвленных полифиалид. Конидиеносцы вначале неразветвленные, позднее слабо разветвленные. Вторичные конидиеносцы обильно ветвятся (рис. 4).

а

б

Рисунок 4 – F. proliferatum : а) короткие цепочки; б) ложные головки;

в) вторичные конидиеносцы

Микрокониди обычно одноклеточные, булавовидные, иногда грушевидные. Макроконидии слегка серповидные, обычно имеют 3–5 перегородок. Хламидоспоры отсутствуют. Красный пигмент не продуцируют [14].

Из пораженных фузариозом корней, семядолей, корзинок были выделены виды F. sporotrichioides Sherb. и F. poae (Peck) Wollenw. из секции Sporotrichiella. Частота встречаемости F. sporotrichioides, F. poae составляла 8,5 и 18,5 % соответственно. Для вида F. poae характерно образование реповидных, круглых, реже грушевидных микроконидий, в основном одноклеточных. Конидиеносцы нераз-ветвленные и разветвленные с короткими монофиалидными конидиогенными клетками ампуловидной или бочонковидной формы (рис. 5). Макроконидии в основ- ном редкие, чаще прямые, довольно широкие по всей длине, часто с вакуолями, преимущественно с тремя перегородками.

а

Рисунок 5 – F. poae (Peck) Wollenw.: а) конидии; б) конидиеносцы с моно-фиалидами

Свежие изоляты вида F. poae имеют фруктовый запах, напоминающий запах персика. Типичные хламидоспоры отсутствуют.

Для вида F. sporotrichioides характерно наличие двух типов микроконидий: а) грушевидных, реповидных и б) веретеновидных, иногда слабо изогнутых. Макроконидии веретеновидно-серповидные, обычно с тремя перегородками (рис. 6).

Рисунок 6 – Конидии вида F. sporotrichioides Sherb.

Хламидоспоры обильные, одиночные, или в цепочках.

Проведенная нами видовая идентификация грибов рода Fusarium показала, что 14,6 % изолятов, выделенных из пораженных органов подсолнечника, принадлежит виду F. solani (Mart.) Saсс. секции Martiella. Для вида характерно обильное образование типичных микроконидий, собранных в ложные головки, часто покрытые слизью. Конидиогенные клетки – монофиалиды. Макроконидии веретено-видно-серповидные, эллиптически изогнутые или почти прямые, с одинаковым диаметром на протяжении большей части длины. Они относительно широкие, толстостенные, типично с тремя перегородками (часто перегородки неотчетливые), с тупой, закругленной апикальной клеткой. Хламидоспоры обильные, одиночные, в парах, в коротких цепочках (рис. 7).

а

б

Рисунок 7 – F. solani (Mart.) Saсс: а) конидии; б) хламидоспоры

Большинство изолятов этого вида выделялось из корней (11,5 %).

В результате проведенного микологического анализа на подсолнечнике обнаружено три вида грибов секции Discolor : F. sambucinum Fuckel., F. culmorum (W.G.

Sm.) Sacc., F. heterosporum Nees. ex Fr. Распространенность видов составляла 4,5; 4,0; 1,0 % соответственно. Из корней выделялся вид F. heterosporum, из корзинок и семян – F. sambucinum . Вид F. culmorum (W.G. Sm.) Sacc. в основном отмечали на семядолях и листьях.

Для этих видов характерно отсутствие микроконидий, конидиогенные клетки – всегда монофиалиды, апикальная клетка короткая, суженная или только сжатая, быстрорастущие культуры. Макроконидии F. sambucinum веретеновидные до ланцетовидных, реже веретеновидносерповидные с конической до клиновидной апикальной клеткой, большей частью с 3–5 перегородками. Клетки в центральной части типично квадратные. Макроконидии F. culmorum имеют более широкий диаметр центральных клеток по сравнению с другими видами секции Discolor. Конидии с 3–5 хорошо заметными перегородками. Апикальная клетка резко суживающаяся, короткая. У вида F. heter-osporum в воздушном мицелии могут образовываться конидии с 0–2 перегородками. Апикальная клетка слегка удлиненная, постепенно и равномерно суженная, несколько изогнутая. Преобладали конидии с тремя перегородками (рис. 8).

в

а

б

Рисунок 8 –

Конидии:

а) F. sambucinum ;

б) F. culmorum ;

в) F. heterosporum

По полученным данным, в последние годы встречаемость видов F. heteros-porum Nees. и F. сulmorum (W.G. Smith) Sacc. снизилась на 5,5 % и 0,5 % соответственно.

Кроме того, в процессе уточнения видового состава из пораженных корней выделялся вид F. equiseti (Corda) Sacc. из секции Gibbosum , частота встречаемости 1,9 %. Макроконидии этого вида толстостенные, с отчетливой изогнутостью в верхней части, с 5–7 перегородками. Апикальная клетка отчетливо изогнутая, вытянутая, постепенно и равномерно суженная. Базальная клетка имеет четко выраженную ножку. Микроконидии не образуются (рис. 8). Около 3,5 % изоля-тов, выделенных из семядолей и корзинок, относились к секции Arthrosporiella виду F. semitectum Berk. & Rav. in Berk. Для этого вида характерно образование в воздушном мицелии веретеновидных, ланцетовидных макроконидий с конической до клиновидной апикальной клеткой, без ножки или с сосочком в основании, 3–5 перегородками (иногда с 6–7) (рис. 9).

а               б

в

Рисунок 9 – Конидии: а) F. equiseti ;

• б)    F. semitectum ; в) конидия F. semitectum с сосочком

Довольно редко (0,6 %) из листьев выделялся вид F. lateritium Neеs. секции Lateritium .

Все выделенные нами изоляты были патогенными, но в разной степени.

Наиболее высокой болезнетворной способностью обладали изоляты видов F. poae, F. sporotrichioides , выделенные из корзинок, семян и корневой системы, развитие болезни достигало 82,6 и 80,9 % соответственно. Патогенность основных возбудителей корневой гнили и трахео-микозного увядания подсолнечника видов F. oxysporum и F. solani варьировала от средней до высокой (50,0–75,0 %). Средней патогенностью обладали виды F. pro-liferatum , F. verticillioides (41,6–56,0 %). Слабая патогенность характерна для изо-лятов, выделенных из листьев.

Выводы . Таким образом, диагностика и видовая идентификация по классификациям Н.П. Шипиловой, В.Г. Иващенко (2008), П.Е. Нельсона с соавторами (Nelson et al., 1983), В. Герлаха и Х. Ниренберг (Gerlach, Nirenberg, 1982) показала, что род Fusarium на подсолнечнике представлен 12 видами из 8 секций. Из пораженных фузариозом семядолей и корзинок выделен вид F. proliferatum (Matsush.) Nirenb., ранее не зарегистрированный на подсолнечнике.

Кроме того, по результатам проведенного микологического анализа наблюдается увеличение частоты встречаемости видов F. verticillioides ( Sacc.) Nirenb., F. poae (Pk) Wr. Sherb., F. solani (Mart.) Sacc. на 3,6; 5,7; 8,0 % соответственно и значительное уменьшение видов F. heterosporum Nees. – на 5,5 %, F. lateritium Neеs. – 2,0 %.

Доминирующими, наиболее патогенными видами на подсолнечнике являются F. oxysporum, F. poae , F. sporotrichioides , F. solani . Они вызывают гнили различных органов растений и трахеомикозное увядание. Выделенные из пятнистостей виды F. culmorum, F. sambucinum в основном были слабо- или среднепатогенные.