Увеличение синтеза коллагена II типа при облучении культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток низкоинтенсивным лазерным излучением длиной волны 633 нм

Введение. В последние десятилетия отмечается рост заболеваний, обусловленных дегенеративно-деструктивными изменениями гиалинового хряща [1]. Данное явление происходит из-за патологических процессов, приводящих к повреждениям фиброзного кольца, состоящего из фиброзно-хрящевой ткани, либо суставной поверхности в случае суставов конечностей. Причин данного явления много. Среди них имеются как генетические эндогенные факторы, так и крайне низкая способность хрящевой ткани к регенерации [1].

Из-за низкой способности гиалинового хряща к регенерации происходит дальнейшая деградация повреждённого слоя, что в конечном итоге приводит к необходимости высокоинвазивных лечебных процедур с длительными сроками восстановления [2]. В настоящее время идет разработка новых методов восстановления структуры как хрящевой ткани в целом [3], так и фиброзного кольца [4].

Одним из таких способов является воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением на повреждённый участок хрящевой ткани [5]. В травматологии и ортопедии известны малоинвазивные методы воздействия на поверхность суставов при различных заболеваниях [6], целью которых является восстановление поврежденного слоя хрящевой ткани. В работе

• [5] описан малоинвазивный метод купирования болевого синдрома при грыжах дисков пояснично-крестцового отдела позвоночника воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения длиной волны 630 нм и мощностью 3 мВт на область локализации межпозвоночной грыжи без катетеризации эпидурального пространства. Однако, несмотря на имеющиеся положительные лабораторные и клинические результаты, механизмы воздействия, лежащие в основе терапевтического эффекта, до сих пор детально не изучены [7].

Данная работа выполнена в контексте изучения влияния лазерного излучения на молекулярные механизмы, лежащие в основе регенерации хрящевой ткани на примере клеточной модели. Было выявлено и проанализировано увеличение экспрессии гена col2a1 в результате облучения культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток низкоинтенсивным лазерным излучением длиной волны 633 нм.

Материалы и методы исследования. Для лабораторных экспериментов использовалась клеточная модель на основе культуры МСК, выделенная из половозрелых крыс третьего пассажа. Работа с экспериментальными крысами полностью соответствовала всем этическим нормам. Мезенхимальные стволовые клетки выделялись из костного мозга бедренной кости в стерильных условиях и культивировались до 3 пассажа в условиях in vitro (37 ^оC 5%CO 2 ) на адгезивном пластике (Nunc, USA). После достижения требуемого пассажа, культура высевалась на четыре адгезивные чашки Петри.

В качестве источника излучения использован лазер длиной волны 633 ± 1 нм и мощностью излучения порядка 1,7 ± 1 мВт. Перед началом эксперимента длина волны источника излучения контролировалась на оптическом монохроматоре с точностью до 1 нм. Схема установки облучения клеток представлена ниже на рис. 1.

Рис. 1. Схема установки: 1 – источник излучения, 2 – устройство ввода излучения, 3 – световод, 4 – выход излучения, 5 – чашка Петри, 6 – СО 2 -инкубатор, 7 – полка инкубатора

Излучение лазера проходит через устройство ввода, в фокусе которого установлен входной торец оптоволокна. На выходе оптоволокна была выставлена мощность излучения порядка 0,8 мВт. По оптоволокну лазерное излучение, через герметичный шлюз, вводится в СО 2 -инкубатор и направляется на чашки Петри с опытной культурой ММСК. Выход волокна располагался на таком расстоянии от полки инкубатора, чтобы в световое пятно одновременно попадали две чашки Петри с культурой клеток. Облучение выполнялось интервалами по 15 мин в час в течение 7-ми суток.

В ходе эксперимента, две из четырех чашек Петри с культурой клеток подвергались лазерному облучению по указанной выше схеме, а другие две чашки содержались в аналогичных условиях, но без облучения. Таким образом, были сформированы основная и контрольная группы наблюдений. По прошествии семи суток наблюдение прекращалось, а образцы помещались при температуре –80 ^оС. После чего из клеточной культуры выделялась РНК и ставилась RT-PCR для определения увеличения экспрессии гена col2a1 , путём измерения разности циклов выхода по сравнению с геном «домашнего хозяйства» в каждой группе. В каждой группе наблюдения было два независимых образца, результаты в которых усреднялись.

Результаты и их обсуждение. Как в контрольной, так и в опытной группе, по окончании семи суток была выделена РНК, поставлена реакция обратной транскрипции с выделением кДНК, а также успешно проведена процедура RT-PCR. По результатам оценки относительного увеличения экспрессии гена col2a1 по сравнению с геном «домашнего хозяйства» был зафиксирован рост экспрессии данного гена более чем в 6 раз по сравнению с контрольной группой.

Полученный результат свидетельствует о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение оказывает воздействие на клеточную регуляцию и приводит к увеличению экспрессии гена col2a1. По видимому, данный факт приводит к увеличению синтеза белков внеклеточного матрикса, среди которых коллаген II типа играет одну из важнейших ролей. Однако конкретные молекулярные механизмы, ответственные за данный факт, пока остаются неизвестными.

С точки зрения практического применения, результат данного лабораторного эксперимента согласуется с клиническим опытом воздействия данного типа излучения на область дегенеративных изменений межпозвоночного диска. У опытной группы пациентов [5] было отмечено купирование локального болевого синдрома в пояснично-крестцовой области, исчезновение симптома Ласега, восстановление чувствительности в сегментах. Отрицательная динамика грыжеобразования в течение пяти лет не зафиксирована (p < 0,05). Увеличение экспрессии гена col2a1 и наличие положительного клинического эффекта в среднесрочной перспективе свидетельствует, на наш взгляд, об увеличении трансляции, то есть, синтеза белка col2a1, а также, возможно, и других белков внеклеточного матрикса. Известны случаи использования лазерного излучения при лечении повреждений поверхностного слоя гиалинового хряща cуставов конечностей [8].

На основании всего вышесказанного целесообразным представляется дальнейшее, более глубокое изучение данного вопроса с целью разработки перспективных малоинвазивных методик лечения.