В-клетки периферической крови при болезни Паркинсона. Клинические и экспериментальные данные

Болезнь Паркинсона (БП) ‒ нейродегенератив-ное заболевание, основными признаками которого являются прогрессирующая гибель дофаминергических (DA) нейронов, появление телец Леви, содержащих агрегаты α-синуклеина, и хроническое нейровоспаление [1, 2, 3, 4, 5]. Наряду с активацией микроглии и повышенной лимфоцитарной инфильтрацией в центральной нервной системе (ЦНС), воспаление при БП сопровождается изменением состава и фенотипа периферических иммунных клеток [4, 5, 6, 7]. Существующие данные указывают, главным образом, на ключевую роль в патогенезе БП периферических Т-клеток и их субпопуляций [4, 5, 6, 7]. Вместе с тем всё большее внимание в последнее время привлекают В-клетки, которые являются важными компонентами адаптивной иммунной системы и включены в патогенез многих заболеваний ЦНС

[8]. Однако данные об изменениях В-клеток при БП противоречивы. Одними авторами показано, что процентное содержание В-клеток снижается и связано со шкалой тяжести заболевания UPRSD [5, 6], другие не обнаружили такой зависимости [7]. При этом существуют лишь единичные работы о содержании и функции CD19+CD25+ регуляторных В-клеток (B-regs) у пациентов с БП [9]. В то же время B-regs рассматриваются как новая популяция клеток, участвующая в воспалительных и аутоиммунных процессах [10, 11, 12, 13, 14], которые могут быть включены в патогенетические механизмы нейродегенеративных заболеваний, включая и БП. Клинические данные подтверждаются результатами, полученными в экспериментальных моделях, среди которых трансгенные мыши А53Т, экспрессирующие мутантный ген α-синуклеина, наиболее полно воспроизводят основные звенья патогенеза БП [15, 16].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

В связи с вышесказанным целью исследования являлось выявление особенностей содержания В-клеток и В-regs в периферической крови у пациентов с БП и у трансгенных мышей линии А53Т с α-синуклеопатией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клиническое исследование

В исследовании приняли участие 19 пациентов (13 женщин и 6 мужчин) с БП, проходивших лечение в А1 Клинике НИИФФМ (г. Новосибирск). Средний возраст в группе пациентов с БП составил 63,4±1,69 года (48–77 лет), средняя продолжительность заболевания ‒ 6,1±0,6 года (2‒16 лет). В группу больных были включены пациенты со II (32%) и III (68%) стадиями заболевания. В качестве контроля были вовлечены 11 практически здоровых лиц (7 женщин и 4 мужчины) близкого возраста ‒ в среднем 59,6±1,63 года (51– 68 лет).

Верификация диагноза идиопатической БП, её формы и стадии проводилась в соответствии с международными клинико-диагностическими критериями Банка головного мозга общества БП Великобритании (UK Parkinson’s Disease Society Brain Bank) и согласно модифицированной шкале стадий заболевания Хен и Яра (Modified Hoehn and Yahr Scale). Все участники подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании.

Кровь у пациентов и здоровых лиц забирали в утренние часы из локтевой вены в пробирки BD Vacutainer CPT, содержащие антикоагулянт и разделительную систему гель/FicollTM, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и центрифугировали при 1800 g в течение 20 минут. Суспензию мононуклеарных клеток (МНК) готовили согласно общепринятым протоколам. Определение В-лимфоцитов и B-regs проводилось методом поэтапного гейтирования с использованием моноклональных античеловеческих антител, конъюгированных с флюорохро-мами (BD PharmingenTM, USA): для CD19 ‒ fluorescein isothiocynate (FITC), для CD25 ‒ phycoerythrin (PE). Для окрашивания клеток 25 мкл суспензии МНК культивировали со смесью антител (по 1,5 мкл каждого антитела) в течение 15 минут в защищенном от света месте. После окрашивания лизировали эритроциты в BD FASC Lysing Solution (Becton Dickinson, USA) в течение 10 минут, клетки однократно отмывали в растворе PBS, осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS. Анализ образцов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). В каждом образце анализировали не менее 50000 клеток. Полученные результаты обрабатывали в программе CellQuest Pro.

Экспериментальное исследование

В работе использовались мыши-самцы линий B6.CG-Tg (Prnp-SNCA*A53T) 23MKle/J (A53T) с гиперэкспрессией мутантной формы человеческого α-синуклеина и С57BL/6J (WT, дикий тип) (n=11 в каждой группе) в возрасте 9,5‒10,0 месяца. Животных получали из SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) и содержали по 5 особей в клетке (40х25х15 см) в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде.

Кровь у мышей забирали после их мгновенной декапитации в пробирки, содержащие K3EDTA (Becton Dickinson, USA). Определение в периферической крови содержания CD19+ В-лимфоцитов и CD19+CD25+ B-regs также проводилось методом проточной лазерной цитофлуориметрии, подобно описанному выше у человека, но с использованием меченых антимышиных моноклональных антител производства BD PharmingenTM (USA) к поверхностным маркерам клеток: СD19 (FITС) и СD25 (Вrilliant Violet 421).

Полученные данные анализировали с помощью статистических программ SPSS (версия 23.0) и Statistica 10. Характер распределения исследуемых параметров оценивали с использованием критериев Колмогорова‒Смирнова и Шапиро‒Уилка. В клинической части исследования для оценки возможных влияний факторов группы (БПБ, здоровые лица), пола, возраста, стадии и продолжительности заболевания на состав лейкоцитов в периферической крови проводили множественный регрессионный анализ. Дальнейшую оценку межгрупповых различий осуществляли с помощью дисперсионного анализа ANOVA, попарное сравнение проводили с применением теста Fisher LSD.

У экспериментальных животных при нормальном распределении показателей достоверность различий в группах оценивали по критерию Стьюдента (t). Данные определяли с учетом стандартной ошибки среднего арифметического (M±m). Выявленные различия считали статистически значимыми при величине p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты множественного регрессионного анализа обнаружили, что для показателя содержания CD19+ В-лимфоцитов фактор группы был статистически незначим (F(1, 24)=0,12, p=0,736). Последующий Post hoc analysis не выявил статистически значимых различий по количеству В-лимфоцитов между пациентами с БП и здоровыми лицами (7,2±0,56 против 6,9±0,59, p>0,05).

Фактор пола оказывал значимое влияние на содержание CD19+ В-лимфоцитов в периферической крови (F (1, 22)=6,09, p=0,021), но только во взаимодействии с фактором группы. Так, у паци- ентов с БП содержание В-клеток среди женщин было выше, чем у мужчин (p<0,05), тогда как здоровые мужчины и женщины не различались по содержанию В-лимфоцитов (табл. 1). Т.е. сам по себе фактор пола не оказывал влияние на содержание В-клеток.

Таблица 1. Содержание В-лимфоцитов и B-regs в периферической крови у здоровых лиц и пациентов с БП в зависимости от пола (M±m)

Популяции клеток; группа	Здоровые лица - контроль (n)	Пациенты с БП (n)
CD19 + В-лимфоциты, % •       Общая группа •      Женщины •      Мужчины	6,9±0,59 (10) 6,4±0,69 (7) 8,1±0,71 (3)	7,2±0,56 (16) 8,1±0,71 (10)# 5,7±0,53 (6)
CD19 + CD25 + В-regs, % от В- клеток •       Общая группа •      Женщины •      Мужчины	1,3±0,34 (8) 1,0±0,23 (5) 1,7±0,87 (3)	4,7±0,72 (16)** 4,9±1,13 (10)* 4,5±0,96 (6) &

Примечание. Уровень достоверности: * - p<0,05, ** - p<0,001, & - p=0,09 по сравнению с соответ ствующей группой здоровых лиц; # - p<0,05 по сравнению с группой мужчин.

Другими авторами также были продемонстрированы различия относительно уровня В-клеток в группах здоровых лиц и пациентов с БП, при этом как больные, так и здоровые женщины отличались более высоким процентным содержанием В-клеток, чем мужчины [6]. Наряду с этим установлена зависимость процентного количества В-клеток от показателей шкалы UPDRS, которое было ниже при более высоких показателях шкалы, что давало основание говорить о негативной корреляции с тяжестью заболевания и сделать заключение о содержании В-клеток как о предикторе прогрессирования БП [6].

Что касается данных о зависимости содержания В-клеток от стадии заболевания, то влияние этого фактора проявлялось во взаимодействии с фактором пола (F(2, 20)=3,59, p=0,046), тогда как фактор стадии заболевания на уровень клеток не влиял. У женщин со II стадией БП содержание

В-лимфоцитов было в 1,5 раза выше по сравнению с таковым числом у здоровых женщин (9,7±1,04 против 6,4±0,68, p<0,001).

Известно, что В-клетки являются важными компонентами адаптивной иммунной системы и, помимо выработки антител, могут выполнять другие функции, включая презентацию антигена Т-клеткам и выработку про- и противовоспалительных цитокинов. Опубликованные в последние годы данные свидетельствуют, что В-клетки включают субпопуляцию В-regs, обладающих иммунорегуляторной функцией, связанной с их способностью продуцировать противовоспалительные цитокины ИЛ-10, ИЛ-35 и TGF-в, которые, в свою очередь, оказывают влияние на Т-regs, Т-хелперы (Тх)1 и Тх17 на разных стадиях развития воспалительной реакции [11, 12, 13]. Предполагается, что B-regs могут вносить вклад в патогенез БП [8, 9].

Таблица 2. Содержание B-regs в периферической крови у пациентов с II и III стадиями БП (M±m)

Популяции клеток; группа/стадия	Содержание клеток, % (n)
CD19 + CD25 + В-regs, % от В-лимфоцитов •       Здоровые лица (контроль) •       Пациенты с БП, стадия II •       Пациенты с БП, стадия III	1,3±0,34% (8) 4,1±1,09% (5) 4,9±0,74% (11)*

Примечание. Уровень достоверности: * - p<0,001 по сравнению со здоровыми лицами

Полученные нами результаты множественного регрессионного анализа выявили значимое влияние фактора группы (здоровые, БП) на содержание CD19+CD25+ В-regs в периферической крови (F(1, 22)=10,22, p=0,004), которое у больных БП более чем в 3 раза превышало таковое количество в группе здоровых лиц (табл. 1). Было обнаружено, что только у женщин повышалось содержание В-regs по сравнению с группой здоровых лиц (p<0,001), тогда как мужчин прослеживалась лишь тенденция к их повышению (p=0,09) (табл. 1). В то же время фактор стадии заболевания оказывал значимое влияние на содержание B-regs (F(2, 21)=5,19, p=0,014). Статистически значимые различия в содержании В-regs со здоровыми лицами (контроль) выявлены у пациентов с III стадией БП (p<0,01, табл. 2). Факторы возраста и продолжительности заболевания не влияли на показатели B-клеток и В-regs ни самостоятельно, ни во взаимодействии с фактором группы.

Анализ содержания CD19+ В-клеток в периферической крови у 10-месячных мышей линии А53Т с повышенной экспрессией α-синуклеина не выявил изменений числа В-клеток по сравнению с мышами WT соответствующего возраста. Со- держание в крови CD19+CD25+ B-regs, определяемое по отношению к числу МНК или В-лимфоцитов, у мутантных мышей также оставалось на том же уровне, как и у мышей WT (табл. 3).

Т а б л и ц а 3. Содержание CD19⁺ В-клеток и CD19⁺CD25⁺ B-regs в периферической крови у мышей линий A53Т и WT в возрасте 10 месяцев

Популяции клеток	Мыши линии WT (M±m)	Мыши линии A53T (M±m)
CD19+ В-клеток, % от МНК	32,5±5,9	27,8±4,3
CD19+CD25+ В-regs, % от МНК	9,5±1,2	10,4±1,8
CD19+CD25+ В-regs, % от В-клеток	31,7±3,8	38,7±4,9

Полученные различия по содержанию В-regs в экспериментальной модели БП и у человека с БП, по-видимому, связаны с тем, что у мышей более значительное накопление α-синуклеина и нарушения нейрохимии мозга могут наступать позднее, чем в 10-месячном возрасте.

Хотя нами не обнаружено изменение числа В-клеток при БП, в то же время у женщин отмечалось более высокое, зависимое от стадии, их содержание, чем у мужчин. Из литературы известно, что у α- syn- / - мышей наблюдаются дефекты В-клеточно-опосредованных иммунных реакций [17], а мыши с дефицитом Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов проявляют устойчивость к MPTP-индуцированной нейродегенерации [18]. Всё вышесказанное указывает на возможность вклада В-лимфоцитов в патогенез БП. Что касается субпопуляции CD19⁺CD25⁺ B-regs, то, несмотря на предположение об их участии в развитии БП [8, 9 ], сведения об изменении содержания данных клеток при этой патологии в литературе отсутствуют. Нами впервые показано значительное повышение B-regs при прогрессировании заболевания. У пациентов с III стадией БП была выявлена наибольшая разница со здоровыми лицами (контроль). Вероятнее всего, это связано с их включением в регуляцию воспалительных и аутоиммунных процессов, наблюдаемых при БП и, таким образом, в нейропротективные механизмы заболевания. Следует отметить гендерные особенности содержания B-regs в крови пациентов с БП, которое у женщин достоверно различается с таковым у здоровых лиц, в отличие от мужчин. Известно, что пол является одним из факторов риска БП, приводятся данные, что мужчины болеют примерно в 2 раза чаще, чем женщины [19 ] и, как уже отмечалось [6 ], высокое содержание В-клеток связано с меньшей тяжестью БП. Выявленные половые различия в содержании В-клеток и B-regs при БП, а также их зависимость от стадии заболевания требуют дальнейшего исследования с привлечением большего количества пациентов, что может стать в будущем основой для разработки новых методов лечения БП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, содержание субпопуляции В-клеток CD19+CD25+ B-regs в периферической крови при БП значительно превышает их уровень у здоровых лиц, при неизменном количестве самих CD19+ В-клеток. Увеличение B-regs зависит от стадии заболевания, так как оно наиболее выражено у пациентов с III стадией БП. Учитывая, что В-regs подавляют участвующие в воспалении Тх1 и Тх17 и дифференцировку и индукцию Т-regs, тормозящих аутоиммунные процессы, можно полагать, что рост их количества говорит об их включении в протективные механизмы развития нейродегенерации и таким образом о тяжести БП.