Вариации содержания сателлита III (1Q12) и рибосомного повтора в ДНК лейкоцитов крови детей с расстройствами аутистического спектра в процессе терапии

Известно, что обострение хронических психических заболеваний сопровождается высоким уровнем психоэмоционального стресса, а также связано с активацией неспецифического воспаления и усилением окислительного стресса [1]. Дети с РАС чаще, чем нормотипичные дети, подвержены неблагоприятному воздействию стресса в связи с высоким уровнем коморбидности РАС с другими расстройствами, в частности с тревожными расстройствами, ОКР, эмоциональными нарушениями. Кроме того, трудности социализации, замкнутость, стеснительность, сенсорные особенности, отсутствие благополучной среды для развития также в значительной степени усиливают дистресс. Высокая степень тревожности у детей с РАС связана с повышенным уровнем гормонов стресса, что было показано в недавнем исследовании [2]. В более ранних работах была описана взаимосвязь между окислительным стрессом и повторяющимися последовательностями ДНК (повторы), которые составляют большую часть генома человека [3]. Многие повторы организованы по типу «голова-хвост» и относятся к типу тандемных повторов [4]. При исследовании геномов пациентов с шизофренией ранее нами обнаружены значительные изменения в содержании двух тандемных повторов у пациентов выборки по сравнению со здоровым контролем ‒ рибосомного повтора и сателлита III (1q12) [5] (рис. 1).

Р и с у н о к 1. Схема анализируемых тандемных повторов генома человека

Показаны используемые для гибридизации ДНК-зонды.

Рибосомный повтор локализован в р-районах 5 пар акроцентрических хромосом и кодирует РНК рибосом [6]. Сателлит III (1q12) входит в состав прицентромерного гетерохроматина первой хромосомы. В условиях стресса и при старении этот повтор транскрибируется [7]. Транскрипция сателлита может приводить к амплификации повтора. В процессе задействована обратная транскриптаза [8]. Кровь пациентов с шизофренией содержит повышенные количества рибосомного повтора и низкие количества сателлита III (1q12) [5]. Содержание сателлита III (1q12) коррелирует с тяжестью психического состояния пациентов [9]. Было показано, что содержание рибосомного повтора в геномах детей с шизофренией статистически значимо повышено по сравнению с геномами детей с РАС и здоровых детей, что потенциально может быть использовано в дифференциальной диагностике этих заболеваний [10]. Однако содержание сателлита III (1q12) в геномах детей с РАС и влияние терапии на этот показатель не определяли. В настоящем исследовании нами впервые установлено количество рибосомного повтора и сателлита III (1q12) в лейкоцитах крови детей с РАС, которые были госпита- лизированы в связи с ухудшением психического состояния, и проанализировано влияние терапии на содержание этих повторов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ содержания повторов генома (рибосомного, сателлита III ‒ 1q12) в образцах ДНК лейкоцитов крови детей с РАС и сопутствующими расстройствами в стадии обострения с целью анализа влияния терапии на содержание этих повторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на базе отдела детской психиатрии (ФГБНУ «Научный центр психического здоровья») и лаборатории молекулярной биологии (ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова».

Основная выборка исследования (основная группа) включала 35 детей в возрасте от 4 до 12 лет (средний возраст 7,2±2,2 года), обратившихся в отдел детской психиатрии ФГБНУ НЦПЗ в связи с обострением психического состояния. Для отбора и включения пациентов в исследование использовали клинико-психопатологический метод, который предполагает психопатологическую оценку поведения пациента в различных ситуаци- ях, анализ эмоциональных и когнитивных реакций и особенностей социального поведения. Состояние пациентов количественно оценивалось по следующим шкалам: тяжесть заболевания ‒ по шкале оценки тяжести (CGI-ADHD-Severity), выраженность клинических проявлений аутистических расстройств ‒ по шкале оценки детского аутизма (Childhood Autism Rating Scale – CARS [11]), выраженность когнитивных нарушений ‒ по шкале оценки развития, психологопедагогический профиль (PEP-3) [10].

Состояние пациентов оценивалось при поступлении, через 2, 4 и 6 недель терапии. Также были взяты пробы венозной крови: проба 1 (n=35) – образцы ДНК детей до начала новой терапии, пробы 2 (n=32), 3 (n=28) и 4 (n=26) – соответственно образцы ДНК, полученные через 2, 4 и 6 недель терапии. Часть детей (n=9) выбыла из эксперимента в силу различных причин.

Критерии включения: пациенты с верифицированными диагнозами по МКБ-10: основной диагноз – детский аутизм (F84.0), атипичный аутизм (F84.1), сопутствующий диагноз – другие тревожные расстройства (F41), реакция на тяжелый стресс и нарушения адаптации (F43), умственная отсталость со значительными нарушениями поведения (F7x.1), смешанные расстройства поведения и эмоций (F92), наличие подписанной формы информированного согласия законных представителей ребенка на участие в исследовании.

Критерии невключения: пациенты с синдро-мальными формами атипичного аутизма (врожденные дефекты обмена веществ, хромосомные аномалии), прогрессирующие дегенеративные заболевания, органические заболевания ЦНС, эпилепсия, наличие клинических признаков обострения аллергических, воспалительных и аутоиммунных заболеваний, проведение вакци-нопрофилактики в течение предшествующих обследованию 2 месяцев, медикаментозная или иная интоксикация, гиперчувствительность к любому из компонентов применяемых в исследовании препаратов, участие в других клинических исследованиях в течение 4 недель перед включением в данное исследование.

Терапия

Все пациенты получали терапию нейролептическими препаратами с целью снятия избыточной раздражительности, психомоторного возбуждения, а также в качестве тимостабилизирующих средств. Были использованы следующие препараты в таблетированной или жидкой форме в качестве монотерапии или аугментации: рисперидон до 2 мг/сут, арипипразол до 15 мг/сут, палипери-дон до 9 мг/сут, перфеназин до 30 мг/сут, хлорпромазин до 100 мг/сут, перициазин до 15 мг/сут, хлорпротиксен до 75 мг/сут, алимемазин до 20

мг/сут. Было получено информированное согласие на применение лекарств off-label от законных представителей пациентов, а также получено разрешение врачебной комиссии ФГБНУ НЦПЗ. В процессе лечения проводилась коррекция доз препаратов для достижения оптимального лечебного эффекта, которая окончательно завершалась к выписке из стационара, при этом все пациенты продемонстрировали стабильную положительную динамику в виде улучшения настроения, снижения тревоги и агрессии.

Группы контроля

В исследовании использовались образцы ДНК жителей Москвы и Московской области (n=191) в возрасте от 5 до 30 лет. Эти образцы были выделены из лейкоцитов крови ранее и хранились при -80°С в коллекции образцов ДНК лаборатории Молекулярной биологии Медикогенетического центра. 91 образец ДНК был выделен из крови детей в возрасте от 3 до 12 лет. 100 образцов ДНК выделены из крови здоровых людей в возрасте от 20 до 30 лет. У участников исследования отсутствовали явные психические или генетические нарушения и не было родственников с генетической патологией.

Лабораторные исследования

Количественный анализ тандемных повторов генома представляет значительные трудности. Метод ПЦР мало применим для этой цели [16]. Биоинформатический подход, основанный на анализе данных секвенирования генома, дает плохо воспроизводимые для одних и тех же образцов ДНК результаты. Авторы связывают этот факт с техническими особенностями метода приготовления библиотек для секвенирования, который включает использование ПЦР [17]. Кроме того, тандемные повторы незначительно представлены в базах данных, поэтому до сих пор составляют «серые зоны» генома [3, 4]. В МГНЦ для количественного анализа тандемных повторов разработан метод нерадиоактивной количественной гибридизации (NQH [14]). Метод положительно зарекомендовал себя при анализе рибосомного и сателлитного повторов [5, 9, 13, 14, 16]. Новый метод секвенирования, который не предполагает создание библиотек (оксфордская нанопора), полностью подтвердил данные для рибосомного повтора, полученные ранее с использованием метода NQH [18]. Метод NQH был применен в данном исследовании для количественного анализа двух повторов. Выделение ДНК из лизированной лейкоцитарной массы после обработки РНКазой А и протеиназой К (метод экстракции органическими растворителями), измерение концентрации ДНК в растворе (флуоресцентная микроскопия, краситель PicoGreen) и анализ содержания повторов в ДНК методом NQH подробно описаны в наших предыдущих публикациях [13, 14] и проводились без изменений. Для анализа рибосомного повтора применяли ДНК-зонд, который содержал EcoRI фрагмент транскрибируемой области повтора (5836 п.н., позиции от -515 до 5321 п.н.; GenBank № U13369), клонированный в плазмиду pBR322 (рис. 1). Зонд на сателлит III ‒ клонированный в плазмиду EcoRI фрагмент области 1q12 длиной 1,77 т.п.н. ‒ известен как pUC1.77 [15]. ДНК-зонды метили ник-трансляцией с использованием biotin-11-dUTP.

Статистические методы

В рамках одного NQH-опыта на фильтр наносили по 3 параллельных пробы каждого образца ДНК. Опыт повторяли 2 раза. Для определения содержания повторов по результатам гибридизации использовали программу Image 6.0 (Медикогенетический центр). Для анализа результатов применяли методы непараметрической статистики Манна-Уитни (сравнение выборок по содержанию повторов, вероятность р) и Колмогорова-Смирнова (сравнение распределений образцов ДНК по содержанию повторов, параметры D и α). Для анализа корреляций между величинами применяли статистику Спирмена. Данные анализировали с использованием пакета StatPlus2007 Professional software (http://www. .

Этический аспект

От участников старше 16 лет получено информированное согласие. Родители участников в возрасте от 5 до 16 лет подписывали информированное согласие на обследование, лечение, отбор венозной крови (6 мл) и проведение научноисследовательских экспериментов с биоматериалом, взятым у ребенка (анализ ДНК).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

До начала терапии в клинической картине заболевания, помимо аутистического симптомо-комплекса, отмечались психомоторное возбуждение, импульсивность, негативизм, эпизоды агрессивного поведения, аффективная патология от непродуктивных гипоманий до депрессивных расстройств с незавершенной депрессивной триадой, раздражительностью и тревогой, нарушения ночного сна с частыми пробуждениями, когнитивный дефицит различной степени выраженности, сопровождаемый нарушением речевой функции. По данным анамнеза изменения в психическом состоянии происходили спонтанно или под влиянием внешней провокации (переезд, посещение новой группы или класса).

По результатам комплексного динамического психологического обследования с использованием стандартизированных методик по шкалам PEP выявлено отставание по количественным показателям РЕР в сферах подражания и коммуникации в сочетании с выраженной диссоциацией указан- ных сфер. Исследование тонкой моторики, зрительно-двигательной координации и вербальной сферы показало небольшое снижение относительно значений нормы. Крупная моторика и восприятие отставали от нормы незначительно. Обследуемые демонстрировали низкую толерантность к нагрузкам, быструю истощаемость психической деятельности (внимания), непоследовательность в выполняемых действиях и, следовательно, низкую продуктивность работы. Наблюдалась небольшая тенденция в зоне ближайшего развития зрительно-двигательной координации. По шкале CARS существенного изменения общего балла не обнаружено. По шкале CGI-S тяжесть психического состояния на фоне проводимой терапии снизилась у всех пациентов основной группы за счет стабилизации настроения, снижения уровня психомоторного возбуждения и купирования агрессии и раздражительности.

На рисунке 2А приводятся данные о содержании рибосомного повтора (параметр R) и сателлита III (1q12) (параметр S) в образцах ДНК, выделенной из лейкоцитов крови детей с РАС. Первоначальная выборка включала 35 детей, госпитализированных в НЦПЗ в связи с обострением психического состояния. Пробы 1 (n=35) – образцы ДНК детей до начала новой терапии, пробы 2 (n=32), 3 (n=28) и 4 (n=26) – соответственно образцы ДНК, полученные через 2, 4 и 6 недель терапии. Часть детей выбыла из эксперимента в силу различных причин.

Содержание рибосомного повтора в ДНК детей варьирует от 211 до 601 копии на диплоидный геном (среднее 419±78, медиана 408 копий, коэффициент вариации 0,19). Пробы 2, 3 и 4 содержали такое же количество повтора, что и проба 1 (рис. 2). Варьирование параметра R в каждой точке не превышало стандартную ошибку опыта (рис. 3А). Таким образом, мы еще раз подтвердили стабильность содержания рибосомного повтора в геноме и независимость этого генетического параметра от терапии антипсихотиками и хронического стресса.

Распределение параметра R в группе обследуемых не отличалось от распределения в группе контроля детей того же возраста (рис. 2Б), что полностью воспроизводит ранее полученный результат [10]. Геномы детей с РАС содержат аналогичное количество копий рДНК, что и геномы здоровых детей.

Содержание сателлита III в ДНК детей с РАС до начала терапии (точка 1) варьирует от 10,2 до 45,5 пг/нг ДНК (среднее 14,4±2,0, медиана 13,6 пг/нг ДНК, коэффициент вариации 0,41). В контрольной выборке детей параметр S варьирует от 11 до 23,3 пг/нг ДНК (среднее 16,9±6,5, медиана 14,1 пг/нг ДНК, коэффициент вариации 0,14).

Р и с у н о к 2. Содержание рибосомного и сателлитного повторов в ДНК лейкоцитов крови детей с РАС

А. Экспериментальные данные, отражающие содержание рДНК (верхний график) и сателлита III (нижний график) в образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов крови детей. Для каждого пациента проводили от 2 до 4 заборов крови в течение нескольких недель (номера проб от 1 до 4). Ось Х: указан порядковый номер обследованного. Приводятся средние значения и стандартное отклонение. Значки (*) и (°) отражают статистически значимые различия (соответственно увеличение или снижение, p<0,05) в содержании повтора в пробах пациента 2, 3 и 4 по сравнению с пробой 1 (до начала терапии).

Б. Сравнение распределений содержания рДНК (слева) и сателлита III (справа) в образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов крови пациентов и здоровых детей группы контроля. Приводится также распределение параметров R и S в более старшей возрастной группе (20-30 лет, n=100). Ось Х: количество копий рибосомной ДНК на диплоидный геном (слева), содержание сателлита III в ДНК пг/нг (справа). Ось Y: кумулятивная частота.

Выборка здоровых детей (группа контроля) статистически значимо отличается от выборки здоровых взрослых меньшими значениями параметра S (рис. 2Б), что подтверждает ранее опубликованные данные [14]. Выборки детей с РАС до терапии и здоровых детей не различаются по значениям параметра S (p>0,5), однако различаются (рис. 2Б) по характеру распределений (D=0,28, α=0,03). Распределения пересекаются в точке 15 пг/нг ДНК. 40% образцов ДНК детей с РАС (точки 1) содержат повышенное количество сателлита III. Вместе с тем 60% образцов, напротив, содержат меньшее количество сателлита III по сравнению с группой контроля. Коэффициент вариации параметра S в основной группе обследуемых был в 3 раза выше, чем в выборке здоровых детей. Более высокое содержание сателлита III в ДНК ассоциировано с накоплением в клеточной популяции клеток с большими блоками сателлита III. Эти клетки не отвечают на различные стимулы, не способны к развитию адаптивного ответа на стресс и демонстрируют низкую устойчивость к окислительному стрессу [19]. Количество таких клеток существенно возрастает при старении культивируемых клеток, в лейкоцитах крови пожилых людей и в условиях окислительного стресса [14, 19]. В то время как накопление таких клеток в лейкоцитах детей с РАС свидетельствует о снижении эффективности их элиминации из кровотока путем апоптоза и/или об усилении процессов, приводящих к накоплению сателлита III в клетках [20].

В отличие от параметра R, параметр S существенно варьировал у большинства пациентов в процессе терапии. Содержание сателлита Ⅲ в ДНК возрастало в ходе терапии в 1,1-2 раза у 18 пациентов (51%), снижалось в 1,1-4,3 раза у 12 пациентов (34%) и оставалось неизменным у 5 пациентов (рис. 2А и рис. 3А).

Р и с у н о к 3. Анализ изменений в содержании двух повторов в образцах ДНК, выделенной из лейкоцитов крови детей с РАС

А. Изменения параметров R и S относительно первоначальных значений до терапии (точка 1).

Б. Иллюстрация изменений в параметрах R и S в зависимости от значений в точке 1. Значения, определенные в пробе 1, ранжированы.

Показано, что изменения параметра S отрицательно коррелируют со значениями в точке 1 (до начала терапии). Содержание сателлита возрастает в случае исходно низкого уровня повтора и снижается в случае исходно высокого уровня (рис. 3Б). В точке 4 распределение для значений S практически не отличается от распределения в группе контроля (рис. 2Б). Таким образом, терапия нейролептиками оказывает модулирующее действие на содержание сателлита III в лейкоцитах крови детей с РАС. Ранее аналогичный результат был продемонстрирован на материале выборки взрослых пациентов с шизофренией, которые впервые проходили курс терапии нейролептиками [9]. Также ранее на модельной системе (культивируемые фибробласты кожи) было показано, что нейролептики снижают содержание сателлита в ДНК клеток. Снижение происходит как за счет блокирования процесса амплификации сателлита, так и за счет ускорения процесса гибели и элиминации клеток с большими блоками сателлита из популяции [20].

Значения параметра S в конце терапии (точка 4) положительно коррелируют с показателями шкал CGI-S (коэффициент Спирмена r=0,45, p=0,025) и BFCRS (r=0,52, p=0,012). Изменения параметра S в течении 2 и 4 недель отрицательно коррелируют с показателем шкалы CGI-S (r=-0,44, p=0,027). Можно предположить, что повышенные значения параметра S в точке 4 ассоциированы с более тяжелым психическим состоянием пациентов на фоне проводимой терапии.

Применение анализа содержания сателлита III (1q12) и рибосомного повтора в ДНК детей с психическими нарушениями перспективно с точки зрения постановки дифференциального диагноза (шизофрения или РАС), оценки состояния детей с РАС и оценки эффективности терапии нейролептиками или другими препаратами, что может лечь в основу будущих исследований. Ограничениями данного исследования являлись малое количество участников выборки, отсутствие оценки влияния каждого из препаратов в отдельности.

ВЫВОДЫ

Вне зависимости от первоначальных значений содержание сателлита III (1q12) в крови детей с РАС и обострением сопутствующей симптоматики стабилизируется на уровне группы контроля на фоне проводимой терапии антипсихотическими препаратами. Вероятно, данные изменения связаны с улучшением психического состояния и снижением общего уровня стресса. Параметр R (рибосомный повтор) на протяжении данного исследования не изменялся.