Вероятностная модель антибиотикотипирования непатогенных актинобактерий

В последнее десятилетие углеводородокисляющие актинобактерии, в частности представители родов Dietzia , Gordonia , Rhodococcus , все чаще становятся объектом фундаментальных исследований в области биохимии, физиологии и генетики микроорганизмов, а также прикладных разработок в области промышленной микробиологии, биотехнологии и биомеханики. Это обусловлено, прежде всего, широкими метаболическими возможностями данных организмов, осуществляющих окисление природных и антропогенных углеводородов, и способностью их выживать в разнообразных, в том числе экстремальных, условиях существования [1]. О повышении интереса исследователей к данной группе микроорганизмов свидетельствует выделение все большего числа штаммов актинобактерий из природных субстратов и соответствующее пополнение генофондов мировых микробных коллекций.

В лаборатории алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения (ИЭГМ УрО) РАН ведутся многолетние исследования биологии и систематики углеводородокисляющих актинобактерий [2, 3]. На базе лаборатории создана Уральская профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов, зарегистрированная во Всемирной федерации коллекций культур ( World Federation for Culture Collection WFCC 768; www.iegm/iegmcol ). В генофонде коллекции 2000 чистых идентифицированных культур, принадлежащих к бактериальным родам Rhodococcus, Corynebacterium, Dietzia, Gordonia, Mycobacterium, Nocardia и выделенных из контрастных экологогеографических регионов нашей страны и зарубежья [4]. В коллекционной работе при проведении таксономических исследований широко используются как традиционные методы бактериальной систематики, основанные на изучении морфологических и физиологических свойств культур, так и современные высокоспециализированные хемотаксономические, иммунохимические и генетические методы.

Следует отметить, что систематика актинобактерий чрезвычайно сложна и до сих пор находится в состоянии становления. Имеют место случаи переноса отдельных видов в другие таксоны, описания новых штаммов и видов и даже появления новых родов. Примером последнего может служить выделение в 1995 году представителей R. maris в самостоятельный род Dietzia [5]. Все вопросы, связанные с прикладными аспектами изучения алканотрофных микроорганизмов, требуют, прежде всего, четкого определения таксономической принадлежности промышленно-ценных культур. В связи с этим, остро стоит проблема родовой и видовой классификации актинобактерий и объективной идентификации природных изолятов. Использование для этих целей, особенно в крупномасштабных таксономических исследованиях, генетических и иммунохимических методов не всегда оправдано из-за сложности постановки тестов и высоких временных и финансовых затрат. Поэтому поиск новых надежных и экспрессных таксономических критериев сохраняет актуальность.

В последние годы новый импульс развития в бактериальной систематике получают методы нумерической таксономии . Это связано с разработкой минимизированных биохимических тестирующих систем и наборов; применением флуорогенных меток для оценки специфической ферментной активности; созданием усовершенствованных компьютерных программ, позволяющих дифференцировать наиболее полезные идентификационные признаки и формировать таксономические базы данных; применением высокоскоростных операционных систем [6].

Известен опыт применения для идентификации коринеподобных и нокардиоподобных актинобактерий идентификационной системы API Coryne [7], включающей R. equi в базу данных. Однако установлено [8], что данная система является недостаточно надежной, поскольку с ее помощью представители R. rhodochrous определяются как R. equi .

При проведении нумерических исследований, наряду с задачей технического усовершенствования процесса тестирования признаков, более важной проблемой остается отбор среди многочисленных фенотипических признаков наиболее стабильных и надежных в таксономическом плане. В этой связи представляет интерес определение чувствительности бактерий к антибиотическим веществам различной природы и механизма действия. Антибиотикочувствительность бактериальных культур широко используется в коллекции ИЭГМ в качестве таксономического маркера при родовой и видовой диагностике актинобактерий, а также подтверждения систематической принадлежности коллекционных и свежевыделенных из природных сред штаммов [9].

Таблица 1

Характеристика чувствительности представителей Rhodococcus erythropolis к ампициллину

Номер штамма, ИЭГМ	7	13	18	22	23	24	26	188	190	199	200
D , мм	29	19	30	29	40	37	38	33	27	30	42
Номер штамма, ИЭГМ	201	202	203	204	208	209	215	216	252	265	267
D , мм	30	28	34	29	19	16	27	33	18	25	37
Номер штамма, ИЭГМ	272	682	683	684	685	686	687	688	689	690	691
D , мм	35	15	16	18	35	25	21	29	18	30	25

Математическая модель антибиотикотипирования

Определение чувствительности штаммов актинобактерий к антибиотикам проводилось методом стандартных индикаторных дисков [10]. Исходная бактериальная взвесь плотностью в 10 Ед оптического стандарта ГИСК готовилась на физиологическом растворе и разбавлялась в 10 раз. Посевная суспензия содержала 10⁹ клеток/мл, выращенных на мясопептонном агаре и отобранных в конце экспоненциальной фазы роста. Бактериальная взвесь в количестве 0,1 мл вносилась в чашки Петри с 5 мл агаризованной питательной среды. Использовались бумажные диски, пропитанные стандартными растворами испытуемых антибиотических веществ. Диски накладывали стерильно на поверхность зараженной питательной среды (по 2-4 диска на одну чашку). Засеянные чашки инкубировались при 28 ° С. Результаты учитывались на третьи сутки путем измерения (в миллиметрах) диаметра D зоны ингибирования бактериального роста вокруг соответствующего диска.

Диаметр D зоны ингибирования роста является количественной мерой уровня чувствительности бактериального штамма к антибиотику. При этом штаммы, принадлежащие к одному виду актинобактерий, проявляют различную чувствительность к индивидуальным антибиотикам. В качестве примера в табл. 1 приведены значения D для представителей вида R. erythropolis в отношении ампициллина.

Подобные таблицы значений D построены для M = 8 видов актинобактерий: R. erythropolis , R. longus , R. fascians , R. opacus , R. rhodochrous , R. ruber , G. rubropertincta , D. maris в отношении A = 19 антибиотиков: ампициллина, бензилпенициллина, гентамицина, доксициклина, канамицина, карбенициллина, линкомицина, налидиксовой кислоты, неомицина, оксациллина, олеандомицина, полимиксина, ристомицина, стрептомицина, тетрациклина, фузидина, хлорамфеникола, цефалексина, эритромицина.

Как видно из табл. 1, наблюдается нерегулярный внутривидовой разброс значений D , что дает основание моделировать D как случайную величину. На основе таблиц экспериментальных значений D были построены эмпирические плотности распределений соответствующих случайных величин [11]. Для построения плотности первоначально все содержащиеся в таблице значения D упорядочивались с учетом

Рис. 1. График эмпирической плотности распределения значений диаметра зоны ингибирования роста представителей Rhodococcus erythropolis по отношению к ампициллину

повторений, то есть находились числа D 1 < D2 <... < Dn (N - количество различных значений D в таблице) и числа к 1, k2,..., kN такие, что значение Dn встречается в таблице kn раз (1 < n < N). Выражение для плотности затем выбиралось в виде ступенчатой функции где

N

Р ^{( x} ) = £ n = 1

k n      2

K D n + i - D n — 1

(   D n — 1 + D n

I ,      2

D n

^{+ D} n + 1

N

K = £ k n , n = 1

f ⁽ x , x 1 , x 2 ) = <

если x1 < x < x2, если x < x1 или x > x2,

и условно введены

D 0 =< 2 D 1 - D 2

- D1

если N = 1, если N > 1 и 3D1 > D2, если N > 1 и 3D1 < D2;

^dn + 1 = ^{2 d}n ^{- d}n - 1 .

Описанным образом были построены плотности p m a ( x ) (1 <  m <  M , 1 <  a <  A )

значений диаметра зоны ингибирования роста для M видов актинобактерий по отношению к A антибиотикам. На рис. 1 в качестве примера приведен график функции p 1 1 ( x ), которая соответствует табл. 1.

Если выбраны B < A различных антибиотиков с номерами а, в ,..., ю, то значения диаметра зоны ингибирования роста для представителей вида актинобактерий с номером m по отношению к этим антибиотикам считаются независимыми случайными величинами; тогда [11] плотность их совместного распределения pm ар...ю(x а,x в

,...,

^x ю ) p m а ^{( x} а ) p m в ^{( x} в )". p m ю ^{( x} ю ^).

Пусть теперь имеется штамм актинобактерии неопределенного видового положения и требуется идентифицировать этот штамм. Пусть неизвестный вид является с равными вероятностями (1/ M ) одним из вышеперечисленных M видов. Выбираются B <  A антибиотиков с некоторыми номерами а , в ,—, ю и экспериментально находятся диаметры D _а , D в ,^, D _ю зон ингибирования роста для данного штамма по отношению к выбранным антибиотикам. Далее находится номер m * вида актинобактерий такой, что величина p_{m а}р,„_ю ( D _а , D в ,..., D _ю ) (1 <  m <  M )

достигает максимума при m = m _∗ (если имеется несколько номеров, отвечающих максимальному значению, то выбирается любой из них). Окончательно делается вывод: исследуемый штамм относятся к виду с номером m _∗ . Нетрудно доказать, что вероятность правильной идентификации штамма

1 +∞ +∞ +∞

P =         ... max pmαβ...ω (xα , xβ xω)dxαdxβ ... d xω

B _{0  0  0} 1 ≤ m ≤ M

Следует заметить, что при заданных α , β ,…, ω , величину P можно подсчитать заранее (до экспериментального нахождения D _α , D _β ,…, D _ω ). Поэтому при выбранном количестве B антибиотиков можно заранее найти оптимальный набор антибиотиков, отвечающий максимальному значению P .

Программная реализация алгоритма антибиотикотипирования

Описанный выше алгоритм идентификации бактериального штамма был реализован в виде программы, работающей в операционной системе Windows . Основное окно программы показано на рис. 2.

Выбрав количество B антибиотиков (один, два или три) и сами антибиотики, следует задать экспериментально найденные значения диаметра зоны ингибирования роста для исследуемого штамма по отношению к выбранным антибиотикам. После нажатия кнопки “Выполнить идентификацию” выводится сообщение о видовой принадлежности исследуемого штамма и значение P вероятности правильной идентификации. Если max pm α β...ω (Dα , Dβ ,..., Dω ) = 0,

1≤m≤M то выводится сообщение “Штамм не относится ни к одному из известных видов ”, хотя, строго говоря, это утверждение противоречит принятому выше предположению, что идентифицируемые штаммы относятся к одному из известных видов актинобактерий, и формально следовало бы выводить название любого из известных видов. Однако в такой ситуации адекватность модели становится проблематичной и это должно быть сообщено исследователю.

При нажатии кнопок из группы “Оптимальные” производится поиск одного, двух или трех антибиотиков, максимизирующих вероятность правильной идентификации штамма. В табл. 2 приведены десять антибиотиков, расположенных в порядке убывания этой вероятности. В табл. 3 и 4 приведены десять пар и троек антибиотиков, аналогично упорядоченных. Следует заметить, что первая пара антибиотиков в табл. 3 не совпадает с первым и вторым антибиотиками из табл. 2; первая тройка антибиотиков в табл. 4 не совпадает с первым, вторым и третьим антибиотиками из табл. 2 и не содержит первую пару антибиотиков из табл. 3. Тем самым, в табл. 2, 3, 4 представлены нетривиальные результаты.

В нижней части основного окна программы помещены список известных видов актинобактерий и кнопка вызова справки.

Таблица 2

Вероятность P правильной идентификации бактериального штамма при использовании одного антибиотика

Антибиотик	P
Фузидин	0,582
Эритромицин	0,549
Карбенициллин	0,538
Бензилпенициллин	0,532
Ампициллин	0,524
Олеандомицин	0,523
Цефалексин	0,510
Хлорамфеникол	0,496
Оксациллин	0,489
Канамицин	0,488

Таблица 3

Вероятность P правильной идентификации бактериального штамма при использовании двух антибиотиков

Антибиотик 1	Антибиотик 2	P
Бензилпенициллин	Фузидин	0,840
Канамицин	Фузидин	0,826
Ампициллин	Фузидин	0,819
Карбенициллин	Фузидин	0,811
Фузидин	Хлорамфеникол	0,805
Бензилпенициллин	Налидиксовая кислота	0,801
Бензилпенициллин	Канамицин	0,798
Канамицин	Эритромицин	0,792
Олеандомицин	Фузидин	0,789
Фузидин	Эритромицин	0,788

Рис. 2. Основное окно программы идентификации бактериального штамма

Таблица 4

Вероятность P правильной идентификации бактериального штамма при использовании трех антибиотиков

Антибиотик 1	Антибиотик 2	Антибиотик 3	P
Бензилпенициллин	Налидиксовая кислота	Эритромицин	0,943
Бензилпенициллин	Канамицин	Эритромицин	0,927
Бензилпенициллин	Канамицин	Налидиксовая кислота	0,927
Канамицин	Фузидин	Эритромицин	0,926
Бензилпенициллин	Фузидин	Эритромицин	0,925
Бензилпенициллин	Канамицин	Фузидин	0,924
Канамицин	Налидиксовая кислота	Эритромицин	0,923
Ампициллин	Налидиксовая кислота	Эритромицин	0,919
Бензилпенициллин	Налидиксовая кислота	Хлорамфеникол	0,919
Канамицин	Оксациллин	Эритромицин	0,919

Заключение

Построена математическая модель антибиотикотипирования непатогенных актинобактерий, позволяющая идентифицировать бактериальные штаммы на основании их чувствительности к антибиотическим веществам и подбирать антибиотики, максимизирующие вероятность правильной идентификации. Разработанная на основании предложенного алгоритма программа широко используется в коллекционной работе Уральской профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН для экспрессной идентификации выделенных из природы штаммов актинобактерий. Дальнейшее развитие и модификация разработанной модели могут состоять в (1) учете других таксономически значимых фенотипических признаков актинобактерий; (2) более точном построении плотностей распределения значений диаметра зоны ингибирования бактериального роста, вызванного действием антибиотика; (3) дополнительном исследовании заложенного в модели предположения о равновероятной принадлежности исследуемого штамма к одному из известных видов актинобактерий; (4) учете неполной экспериментальной информации об антибиотикочувствительности актинобактерий (имеется ряд антибиотиков, по отношению к которым определена чувствительность представителей не всех видов актинобактерий, и ряд штаммов, чувствительность которых определена в отношении не всех антибиотиков).

Благодарности

Исследования частично поддержаны грантом Программы Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» (Направление 7. Проект 7.4).