Видовая принадлежность и серогрупповая вариабельность стрептококков, выделяемых от свиней в Краснодарском крае

Автор: Толстова Е.А., Агольцов В.А., Черных О.Ю., Семиволос А.М., Падило Л.П., Попова О.М.

Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана @uchenye-zapiski-ksavm

Статья в выпуске: 3 т.255, 2023 года.

Бесплатный доступ

Использование комплексной лабораторной диагностики, включающей в себя бактериологический, серологический, биохимический и биологический методы исследований при стрептококкозе свиней позволили определить виды, серогрупповую принадлежность и патогенность стрептококков, циркулирующих у свиней в Краснодарском крае. При исследовании патматериала от свиней (свиноматок; носовые смывы, трупы поросят) были выделены S. pneumonia, S. zooepidemicus, S. faecalis и впервые S. uberis. При определении серогрупповой принадлежности стрептококков в реакции преципитации установили, что в основном среди свиней Краснодарского края циркулируют патогенные варианты серологических групп: B, G, I, R.

Еще

Стрептококкоз свиней, виды стрептококков, лабораторная диагностика

Короткий адрес: https://sciup.org/142238923

IDR: 142238923 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_2_255_329

Текст научной статьи Видовая принадлежность и серогрупповая вариабельность стрептококков, выделяемых от свиней в Краснодарском крае

Стрептококкоз свиней представляет собой, как самостоятельное заболевание, так и возникающий на фоне целого ряда инфекционных патологий, который может вызывать тяжелые поражения, в виде менингита, артрита, бронхопневмоний и других патоморфологических изменений [3, 4, 5].

Первой стадией патогенного процесса, является прикрепление и колонизация на слизистой оболочке или на эпителиальных поверхностях хозяина. Второй этап – инвазия в более глубокие ткани и внеклеточная транслокация бактерий в кровяное русло, либо свободно находящихся в циркуляции, либо прикрепленных к поверхности моноцитов. Если S. pneumonia, S. uberis, S. faecalis, S. Zooepidemicus, присутствующие в крови, не вызывают септицемию со смертельным исходом, то стрептококкоз может перейти в третью стадию, включающую проникновение в органы хозяина, в основном путем преодоления гематоэнцефалического барьера, чтобы получить доступ к центральной нервной системе (ЦНС) и вызывать менингит. Четвертая стадия – воспаление, которое имеет связующую роль в патогенезе как системных инфекций, так и инфекций ЦНС. Патоген может индуцировать перепроизводство провоспалительных цитокинов, вызывающих септический шок, или привлечение и активацию различных популяций лейкоцитов, вызывая острое воспаление ЦНС [4, 5, 6].

На всех стадиях патогенного процесса S. pneumonia, S. uberis, S. faecalis , S. zooepidemicus взаимодействует со многими типами иммунокомпетентных клеток хозяина, такими как полиморфноядерные лейкоциты, мононуклеарные макрофаги, лимфоциты, дендритные клетки и микроглия, используя ряд универсальных факторов вирулентности для уклонения от врожденной и адаптивной иммунной защиты хозяина, и для преодоления экологического стресса [7, 8, 9].

Частота встречаемости, тяжесть клинических проявлений стрептококкоза свиней, а также распространенность видов стрептококков, устойчивых к антимикробным агентам, несмотря на проводимую интенсивную антибактериальную терапию, определяют необходимость постоянного мониторинга возбудителей и расширения исследований по повешению эффективности лечения и специфической профилактики стрептококкоза свиней в Краснодарском крае. [7,8,10].

Целью проведения исследований явилась необходимость дифференциации видовой принадлежности и серогрупповой вариабельности стрептококков, выделяемых от свиней и их патогенность.

Материал и методы исследований.

Исследования проводились на базе

Кропоткинской краевой ветеринарной лаборатории. Были применены микроскопические, культуральные и биологические методы исследований. Материалом для лабораторных исследований служили: влагалищные смывы от заболевших свиноматок, смывы из носовых ходов и трупы поросят в возрасте от 1 до 4 месяцев, павших от стрептококкоза. Для определения видов стрептококков использовали СТРЕПТОтест 16, предназначенный для биохимической идентификации стрептококков. Данный набор позволяет проводить до 60-ти определений по 16-ти биохимическим тестам с возможностью визуальной и автоматизированной оценки результатов биохимических реакций по идентификационной таблице. Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков использовали стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки ФГБУ ВГНКИ. Определение патогенности стрептококков проводили на трех белых беспородных мышах 15-16 г. Для заражения использовали 18-часовые культуры стрептококков. Культуру в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно.

Результат исследований.

Возбудители болезни относятся к роду Streptococcus, который включает более 20 серологических групп стрептококков, различающихся антигенными свойствами.

Кроме стрептококков от животных часто выделяли другие грамположительные кокки. Для первичной дифференциации использовали характерные признаки в соответствии с рекомендациями (Таблица 1).

Результаты, полученные при проведении лабораторных диагностических исследований патматериала, поступавшего в Кропоткинскую краевую ветеринарную лабораторию за последние четыре года (с 2019 по 2022гг.), свидетельствуют о высокой частоте обнаружения стрептококков (Таблица 2).

Таблица 1 – Отличительные особенности родов семейства Streptococcaceae

Наименование рода	Характерные признаки
Streptococcus	Клетки делятся в одной плоскости. Глюкозу ферментируют до образования молочной кислоты без выделения углекислого газа
Leuconostoc	Клетки делятся в одной плоскости. Глюкозу ферментируют с образованием углекислого газа
Pediococcus	Клетки делятся в двух плоскостях, образуя тетрады. Глюкозу ферментируют до образования молочной кислоты без выделения углекислого газа.
Aerococcus	Клетки делятся в двух плоскостях, образуя тетрады. Глюкозу ферментируют до образования молочной кислоты без выделения углекислого газа.
Gemella	Клетки делятся в одной плоскости. По Граму окрашиваются негативно.

Таблица 2 – Статистические данные по стрептококкозу свиней в Краснодарском крае за 2019-2022гг

Год	Количество проб патматериала	Проведено исследований			Получено положительных результатов
Год	Количество проб патматериала	Микроскопических	Бактериологических	Биологических	Получено положительных результатов
2019	33	33	13	4	14
2020	36	36	36	9	12
2021	40	40	40	8	15
2022	15	15	15	5	3

Высевы из патологического материала делали пастеровской пипеткой в мясо-пептонный бульон с 1 % глюкозы и 10 % инактивированной нормальной сывороткой лошади и на мясо-пептонный агар с 1 % глюкозы и 5-10 % дефебринированной крови барана. Посевы инкубировали в термостате при 37 °С в течение 19 часов. На глюкозо- кровяном агаре стрептококки росли в виде мелких, прозрачных и слегка мутноватых колоний, которые были окружены зоной гемолиза.

S. pneumonia - круглые, плоские, полупрозрачные колонии, диаметром 0,50,8 мкм. Иногда встречались мукойдные колонии – они были более крупные, слизистой консистенции. На сывороточноглюкозном бульоне росли с равномерным помутнением среды с образованием осадка (Рисунок 1).

S. uberis - на кровяном агаре формировал колонии: крупные, блестящие, вязкие, с неровными краями, прозрачные,

матовые, мелкие, диаметром 0,1-0,2 мм. На сывороточно-глюкозном бульоне росли с равномерным помутнением.

S. zooepidemicus – образовывал мелкие колонии, блестящие, вязкие, в виде капли воды, серые, диаметром 0,1-0,3 мм.
S. faecalis – колонии округлой формы, с ровными краями, диаметр 1,52 мм, с красноватым оттенком (Рисунок 2). При выделении стрептококков серологической группы Д определяли разновидность энтерококков. Для этого использовали среду с теллуритом калия или энтерококковую дифференциальнодиагностическую среду.

Культура S. faecalis устойчива к теллуриту калия (0,07 %) и хорошо растет на плотной среде в его присутствии, образуя колонии черного цвета. На дифференциально-диагностической среде через 15 ч роста колонии S. faecalis приобретают вишнево-красный цвет.

Рисунок 1 – S. pneumonia

Рисунок 2 – S. faecalis

Таблица 3 – Виды стрептококков, выделенные от свиней в Краснодарском крае за 2019- 2022гг

Год	Район	Исследовано проб	Исследуемый материал	Вид и частота выделения стрептококков
2019	Усть-Лабинский	3	Смывы из влагалища свиноматок	S. uberis 3
	г. Краснодар	8	Смывы из влагалища свиноматок, трупы поросят, носовые смывы	S. pneumonia 4, S. uberis 2, S. faecalis 2
	Новопокровский	3	Смывы из влагалища свиноматок, носовые смывы	S. uberis 2, S. pneumonia 1
2020	Выселковский	6	Носовые смывы	S. pneumonia 6
2020	г. Краснодар	6	Смывы из влагалища свиноматок	S. uberis 6
2021	г. Краснодар	15	Носовые смывы, трупы поросят	S. pneumonia 13 S. zooepidemicus2
2022	г. Краснодар	3	Носовые смывы, трупы поросят	S. uberis 1, S. pneumonia 2

Таблица 4 – Идентификационная таблица СТРЕПТОтест 16

Показатель

Ряд1

STREPTOtest 16

Ряд 2

Серогруп па

s щ к

>н

Рн

Н Рн

(Z)

H—

Pi c

H-

–

(–)

–

S.pyogenes

(+)

–

(+)

–

(+)

S.agalactiae

–

S.dysgalactiae

–

S.equi subsp. equi

–

(–)

–

(+)

S.equi subsp. zooepidemicus

–

(+)

–

(–)

–

S.equisimilis

–

(–)

–

(–)

(+)

–

S.group G

–

(+)

–

S.group L

E, P, U, V

–

(+)

–

(+)

S.porcinus

R, S, RS, T

–

(+)

–

S.suis

F, C, (G, A)

–

(–)

–

(+)

–

(–)

–

S.anginosus

F (C, G)

–

(+)

(–)

–

S.constellatus

F, C (G)

–

S.intermedius

–

(+)

–

(+)

–

S.mutan s“group”

–

(+)

–

S.salivarius

–

(+)

–

S.vestibularis

–

(+)

–

S.bovis I

–

(–)

(+)

–

S.bovis II/1

–

(+)

–

(–)

–

S.bovis II/2

–

(–)

–

(–)

–

S.equinus

–

(–)

–

(–)

–

S. uberis

–

(–)

–

(–)

–

(+)

S.parauberis

–

(–)

–

(–)

–

(+)

–

(–)

S.acidominimus

–

(–)

–

(+)

(–)

–

(+)

–

S.pneumoniae

–

(–)

–

S.mitis 2

–

(–)

–

S.oralis / mitis 1

–

(–)

(+)

–

S.sanguis esl+

–

(+)

–

(+)

–

S.sanguis esl–

–

(+)

–

S.gordonii

–

(–)

(+)

–

(–)

(+)

–

(–)

(+)

(–)

–

Aerococcus viridans

Пояснения:

+ = положительная реакция

d = вариабельная реакция

– =отрицательная реакция

-+) = большей частью положительная реакция

( – ) = большей частью

отрицательная реакция

HEM = β-гемолиз

PYR = пирролидонилариламидаза (ПИРАтест)

VPT = ацетон (VPtest)

Примечание: для зеленящих стрептококков в случае неоднозначной идентификации можно проводить идентификацию до:

S. salivarius group = S. salivarius, S. vestibularis; S. milleri group = S. anginosus, S.

constellatus, S. intermedius; S. sanguis group = S. sanguis, S. gordonii; S. mitis group = S. mitis, S. oralis; (RUOFF, K. L. 1995. Streptococcus, p. 299–307. In: P.R. Murray et al. (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. ASM, Washington

Streptococcus uberis является экологическим патогеном, ассоциированным с субклиническим и клиническим маститом, как у лактирующих, так и у нелактирующих коров, который может сохраняться в вымени и вызывать хроническую инфекцию в молочной железе [1, 7, 10].

Эталонный штамм S. uberis 0140J является условно-патогенным микроорганизмом, который может адаптироваться к различным экологическим нишам благодаря своей питательной гибкости. Этот вездесущий микроорганизм был выделен из кожи, губ и миндалин коров, в полости рта, рубце, прямой кишке и дыхательных путях, на коже сосков и каналах, а также в инфицированном вымени и фекалиях [2, 3, 10]. S. uberis также может быть выделен из окружающей коровы среды в виде отработанного молока, воды для очистки, подстилки для пастбищ и амбаров. Все это является основным источником инфекции. Коровы выделяют S. uberis со своими фекалиями через слизистые оболочки пищеварительного тракта, что может объяснить широкое распространение и поддержание этого патогена в молоке. Участки рядом с доильным залом богаты органическими веществами (фекалиями, молоком), которые могут попадать на вымя. Когда сосковые каналы открыты, фекальное загрязнение вымени может способствовать проникновению микроорганизмов [3, 10, 12].

Более того, патоген распространяется в слизистых оболочках полости рта и губ при облизывании шерсти и эпидермиса других коров. S. uberis может сохраняться в результате фекальноорального цикла передачи. До сих пор роль микробиоты молочной железы крупного рогатого скота во взаимодействии хозяин– патоген была плохо изучена, и в основном во время инфекционного процесса. У здоровых лактирующих коров исследовали микробный состав и разнообразие из фекалий, молока и лейкоцитов крови [3, 10, 11]. Для определения видовой принадлежности проведены биохимические исследования выделенных культур стрептококков. Продуцирование сероводорода, аммиака и индола определяли с использованием индикаторных бумажек при инкубации стрептококков в МПБ с добавлением 0,2 % глюкозы.

Для определения сахаролитических свойств стрептококков, исследуемые культуры засеяли на специальные питательные среды Гисса. Использовали питательные среды с 12 углеводами и спиртами: раффиноза, ксилоза, сахароза, галактоза, мальтоза, декстроза, глюкоза, маннит, дульцит, лактоза, арабиноза, инулин. Результаты видовой принадлежности стрептококков представлены в таблице 3.

Для идентификации видового состава стрептококков применяли таблицу СТРЕПТОтест 16 (Таблица 4).

Таблица 5 – Результаты постановки реакции преципитации со стрептококками

Серологическая группа стрептококков	Патматериал	Частоты выделений, %
B	Смывы из влагалища свиноматок	17
C	-	-
E	-	-
G	Смывы из влагалища свиноматок; Носовые смывы, трупы поросят	58
D	-	-
I	Носовые смывы, трупы поросят	15
R	Носовые смывы, трупы поросят	10
S	-	-

Серогрупповую принадлежность стрептококков определяли в реакции преципитации в капиллярах, с преципитирующей сывороткой, по методике ФГБУ ВГНКИ (Таблица 5).

Определение патогенности стрептококков проводили на трех белых беспородных мышах массой 15-16 г. для каждой установленной серогруппы стрептококков. Для заражения использовали 18-часовые культуры стрептококков. Культуру в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно. Культуру признают патогенной при гибели не менее двух мышей.

При заражении патогенной культурой стрептококков мыши погибали в течение 1-2 суток (Таблица 6).

Таблица 6 – Результаты постановки биопробы различными серологическими группами стрептококков на белых мышах

Серологическая группа	Гибель мышей, сутки		Микроскопия мазка печени мышей по Граму
Серологическая группа	1 сутки	2 сутки	Микроскопия мазка печени мышей по Граму
B	-	+	+
G	+	-	+
I	+	-	+
R	-	+	+

Из органов павших мышей готовили мазки, окрашивали по Граму, микроскопировали под иммерсионной системой при увеличении х 100.

Заключение. Использование комплексной лабораторной диагностики, включающей в себя бактериологический, серологический, биохимический и биологический методы исследований при стрептококкозе свиней позволили определить виды, серогрупповую принадлежность и патогенность стрептококков, циркулирующих у свиней в Краснодарском крае. Кроме того, впервые в значительном количестве проб патматериала удалось выявить от свиней S. uberis, ранее не являющийся эпизоотически значимым видом стрептококков , который ранее считался причиной маститов у крупного рогатого скота.

Резюме

Использование комплексной лабораторной диагностики, включающей в себя бактериологический, серологический, биохимический и биологический методы исследований при стрептококкозе свиней позволили определить виды, серогрупповую принадлежность и патогенность стрептококков, циркулирующих у свиней в Краснодарском крае. При исследовании патматериала от свиней (свиноматок; носовые смывы, трупы поросят) были выделены S. pneumonia, S. zooepidemicus, S. faecalis и впервые S. uberis . При определении серогрупповой принадлежности стрептококков в реакции преципитации установили, что в основном среди свиней Краснодарского края циркулируют патогенные варианты серологических групп: B, G, I, R.

Список литературы Видовая принадлежность и серогрупповая вариабельность стрептококков, выделяемых от свиней в Краснодарском крае

Панин, А. Н. Методика и условия постановки реакции коагглютинации для определения серогрупповой принадлежности стрептококков / А.Н. Панин, В. К. Астафьева // Всесоюзная научная конференция: Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов – 1991. – С.168-170.
Рыжакина, Е. А. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций животных: Методические указания / Е. А. Рыжакина // Вологда – Молочное: Вологодская ГМХА – 2016. – 19 с.
Терехов, П. Ю. Стрептококкозы свиней / П. Ю. Терехов, А. В. Капустин // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко – 2019. – С. 27-34.
Толстова, Е. А. Особенности диагностики и терапии стрептококкоза свиней, осложненного РРСС на племенной ферме / Е. А. Толстова, В. А. Агольцов, Л. П. Падило // Научная жизнь – 2022. – Том 17. – Выпуск 1 – С. 157-166.
Толстова, Е. А. Особенности диагностики и терапии стрептококкоза свиней на племенной ферме / Е. А. Толстова, В. А. Агольцов, О. М. Попова // Проблемы и пути развития ветеринарной и зоотехнической наук Международная научно-практическая конференция обучающихся, аспирантов и молодых ученых, посвященная памяти Колесова А.М. // Саратовский источник – 2022. – С.123-130.
Толстова, Е. А. Диагностика, терапия и специфическая профилактика стрептококкоза свиней, осложненного пастереллезом и микоплазмом / Е. А. Толстова, М. М. Лигидова, Л. П. Падило, А. М. Семиволос, В. А. Агольцов // Аграрный научный журнал – 2022. – №1 – С.71-75.
Шевченко, А. А. Рекомендации по лабораторной диагностике стафилококкозов и стрептококкозов животных / А. А. Шевченко, О. Ю. Черных, В. Н. Шевкопляс, Л. В. Шевченко // Краснодар: КубГАУ – 2008. – 31с.
Эпизоотология с микробиологией: учебник для вузов / А. С. Алиев, Ю. Ю. Данко, И. Д. Ещенко [и др.] – Санкт-Петербург: Лань, 2022. – 432с. – ISBN 978-5-507-44161-7.
Amaro, R. Development and characterization of a new swine model of invasive pneumococcal pneumonia / R. Amaro, G. Li Bassi, A. Motos, L. Fernandez-Barat // Lab Anim (NY). – 2021 – Nov;50(11) – P. 327-335.
Fessia, A. S. Potential factors involved in the early pathogenesis of Streptococcus uberis mastitis: a review / A. S. Fessia, L. M. Odierno // Folia Microbiol (Praha). – 2021 – Aug; 66(4) – P. 509-523.
Costa, M. O. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus infection of pigs leads to shedding in faeces and a carrier state / M. O. Costa, J. C. S. Harding, Y. Huang, R. Nosach // Transbound Emerg Dis. – 2022 – Sep;69(5) – P.1503-1509
Chen, X. Genetic characterization of Streptococcus equi subspecies zooepidemicus associated with high swine mortality in the United States / X. Chen, N. Resende-De-Macedo, P. Sitthicharoenchai, O. Sahin [et al.] // Transbound Emerg Dis. – 2020 – Nov. 67(6) – P. 2797-2808.

Еще

Статья научная