Видовой состав и токсикологическая характеристика грибов рода Aspergillus, выделенных из грубых кормов

Негативное воздействие микроскопических грибов рода Aspergillus на животных проявляется не только в виде микозов — заболеваний, вызываемых патогенными видами (1, 2), но и отравлений продуктами метаболизма с широким спектром повреждающего действия, включая нейротоксичность с тре-моргенным эффектом, гепато- и нефротоксичность (3, 4). Несмотря на неоднократно полученные свидетельства о значительной пораженности кормов этими грибами, риски, связанные с аспергиллотоксикозами, до сих пор остаются неясными. В мировой литературе можно найти сведения о токси-нообразовании для отдельных видов грибов этого рода, однако они получены, как правило, для малого числа изолятов, в разных условиях и чаще всего по одному или немногим близкородственным токсинам (5, 6). Все это созда-1279

ет затруднения или делает невозможным даже приблизительный анализ ситуаций, которые могут возникать при кормлении и содержании животных.

Грубые корма, ежегодно в больших масштабах пополняющие базу российского кормопроизводства, вызывают обеспокоенность специалистов в связи с множественной сочетанной контаминацией микотоксинами (7, 8) и обширным распространением грибов родов Aspergillus , Penicillium , Fusarium и многих других, в том числе токсигенных видов. Недавно установлено, что доминирующая роль среди фузариевых грибов в этих кормах принадлежит F. sporotrichioides (9), продукты метаболизма которого — Т-2 токсин и ди-ацетоксисцирпенол способны вызывать острые отравления животных.

Мы впервые провели направленный поиск токсинообразующих грибов рода Aspergillus среди видов, участвующих в поражении сена и соломы. Новый подход к тестированию изолятов на альтернативных ростовых средах позволил подтвердить возможность биосинтеза микотоксинов у 7 видов Aspergillus из 15 идентифицированных в составе микобиоты. Особый интерес представляют данные по редко встречающимся видам A. tamarii , A. repens и A. wentii , поскольку информация относительно их токсигенного потенциала весьма ограничена.

Целью работы было изучение видового состава грибов рода Aspergillus в грубых кормах и оценка токсинпродуцирующей способности этих изолятов в экспериментальных условиях, обеспечивающих наиболее полную реализацию их потенциала.

Методика. Объектами микологического анализа были 258 средних образцов от производственных партий сена и соломы, заготовленных в животноводческих хозяйствах. Из Брянской области (8 районов, 2011 год) было получено 14 образцов сена (злаки, луговые травы, райграс, разнотравье) и 5 образцов соломы (состав не указан); из Московской области (31 район, 2013 год) — 230 образцов сена (разнотравье, злаки, многолетние травы, сборное, луговое, тимофеевка, злаково-бобовое, костер, люцерна, овсяница, вика, козлятник, клевер) и 9 образцов соломы (вико-овсяная, злаковая, пшеничная, овсяная). Материал для посева подготавливали, как описано ранее (9). Каждый образец нарезали на фрагменты длиной около 2 см и тщательно перемешивали. В три чашки Петри раскладывали по 20 фрагментов, соблюдая примерно одинаковые расстояния между ними. Агар Чапека содержал медицинскую консервированную желчь (10 %) и антибиотики (50 тыс. ЕД пенициллина и 100 тыс. ЕД стрептомицина на 1 л среды). Затем чашки помещали в термостат при 25 ° С. Через 5-7 сут подсчитывали число фрагментов с признаками поражения грибами Aspergillus , вычисляли процентное содержание от общего числа и начинали выделение чистых культур. Для этого колонии, относящиеся по культуральным признакам к роду Aspergillus , высевали в чашки Петри с тем же агаром, а через 5-7 сут после подтверждения чистоты отсевали на скошенный агар Чапека-Докса (ЧДА). Видовую идентификацию грибов осуществляли по определителю (10).

Методика оценки токсинообразования грибов включала подготовку инокулюма, субстрата, посев, культивирование, экстракцию и анализ микотоксинов. В качестве посевного материала использовали 10-суточные культуры грибов на ЧДА. Инокулюм примерно равного размера, взятый с поверхности агара микологическим крючком, помещали в три флакона объемом 10 мл с диаметром дна около 18 мм, каждый из которых содержал по 1 г стерильного дробленого зерна риса, предварительно увлажненного добавлением 1 мл воды, а также в три флакона с 1,5 мл ЧДА или суслового агара (СА) (Wort agar, «Liofilchem», Италия). Флаконы закрывали ватно-марлевыми пробками, которые плотно оборачивали лабораторной пленкой Parafilm M® (РМ-996, «Pechiney Plastic Packaging», США). 1280

Культивирование проводили в темноте в течение 7 сут при 23 ° С. Затем в каждый флакон добавляли смесь ацетонитрила и воды (объемное соотношение 84:16) и интенсивно встряхивали в начале и конце 14-часовой стационарной экстракции. Содержание стеригматоцистина (СТЕ), эмодина (ЭМО), афлатоксина В₁ (АВ₁), охратоксина А (ОА), микофеноловой кислоты (МФК), циклопиазоновой кислоты (ЦПК), эргоалкалоидов (ЭА), дез-оксиниваленола (ДОН) и фумонизинов (ФУМ) в экстрактах определяли методом иммуноферментного анализа с помощью аттестованных тест-систем (11), нижние пределы чувствительности определения соответствовали 85 % связыванию антител. Для оценки токсинообразования использовали 32 изолята 12 видов грибов рода Aspergillus из сена и соломы, а также 27 изолятов A. flavus , A. pseudoglaucus , A. repens , выделенных ранее из зерновых кормов и принадлежащих исследовательской коллекции (Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии).

Полученные данные анализировали методами описательной статистики в программе Microsoft Excel 2013. В таблицах приведены средние арифметические значения ( X ) и ошибки выборочной средней (s).

1. Видовой состав и распространенность грибов рода Aspergillus в грубых кормах (сено, солома), заготовленных в Брянской (8 районов, 2011 год) и Московской (31 район, 2013 год) областях ( n = 160)

Группа	Вид	Частота встречаемости, %
A. flavus	A. flavus Link	56,3
	A . tamarii Kita	3,1
A. niger	A. niger van Tieghem	54,4
A. versicolor	A. versicolor (Vuill.) Tira-
	boschi A. sydowii (Bain. & Sart.)	18,8
	Thom & Church	2,5
A. glaucus	A. pseudoglaucus Blochwitz A. amstelodami (Mangin)	15,6
	Thom & Church	10,6
	A. repens de Bary A. chevalieri (Mangin)	1,9
	Thom & Church	0,6
A. ochraceus	A. ochraceus Wilhelm	15,0
A. wentii	A. wentii Vehmer	14,4
A. nidulans	A. nidulans Eidam	6,3
A. candidus	A. candidus Link	4,4
A. fumigatus	A. fumigatus Fresenius	2,5

A. terreus

A. terreus Thom

Не определена Aspergillus spp.

П р и м е ч а н и е. n — число проб, пораженных аспергиллами.

0,7

3,8

Результаты. Грибы рода Aspergillus присутствовали в 62,0 % из 258 исследованных проб с интенсивностью инфицирования от 1,7 до 100 %. После выделения в чистые культуры изоляты грибов этого рода были отнесены к 15 видам, входящим в 10 таксономических групп (табл. 1). Видовое разнообразие оказалось наибольшим в группе A. glau-cus — 4 вида ( A. pseudoglaucus , A. repens , A. amstelodami , A. che-valieri ), в остальных обнаружили по 1-2 вида. Идентифицировать до вида изоляты из 13 проб не удалось из-за утраты культур на ранних этапах выделения, однако по предварительной оценке 7 из них относились к группе A. glaucus .

По частоте обнаружения лидировали виды A. flavus и A. niger (более 50,0 % пораженных проб), далее следовали A. versicolor, A. pseudoglau-cus, A. amstelodami, A. ochraceus и A. wentii (10,6-18,8 % проб), A. nidulans (6,3 %), остальные 7 видов — A. candidus, A. tamarii, A. sydowii, A. fumigatus, A. repens, A. terreus и A. chevalieri встречались еще реже (< 5 %). Эти результаты в целом совпадали с полученными ранее на других территориях — в Рязанской Мещере (12), Татарстане (13, 14), Дагестане (15), Северной Осетии (16) и Амурской области (17), а также в бывших республиках СССР — Украине (18), Белоруссии (19), Литве (20), Армении (21, 22), Казахстане (23) и Азербайджане (24, 25). Во всех исследованиях сообщалось, что грибы рода Aspergillus доминируют в составе микобиоты грубых кормов и представлены многими видами с преобладанием A. flavus и A. niger. Сходство, хотя и с некоторыми различиями, касалось и сопутствующих видов — A. fumigatus, A. nidulans, A. ochraceus, A. versicolor, A. candidus, A. wen- tii, группы A. glaucus. Среди редких находили A. clavatus (16, 18, 21, 25), A. fla-vipes (22), A. oryzae и A. ustus (16).

По-видимому, комплекс видов Aspergillus и наблюдаемое соотношение между ними были следствием длительных конкурентных взаимосвязей грибов и формировалось в процессе высушивания травостоя. Трудно предположить, чтобы у такого многообразия вегетирующих растений подверженность воздействию грибов была настолько одинаковой. Понятно, что на живых растениях могли активно развиваться иные виды, а те, что доминировали в итоге, — иметь при вегетации второстепенное значение. По нашему мнению, этот научный факт и высказанное предположение заслуживают особого внимания, поскольку указывают на необходимость учета биосинтетического потенциала не только распространенных, но и редко выявляемых видов для корректного прогнозирования рисков контаминации кормов.

Методология оценки токсинообразования для этой группы грибов, по доступным нам сведениям, не была предметом специального изучения. Тем не менее, в других работах для тестирования и препаративного получения микотоксинов использовалась среда Чапека-Докса (26), оценка изо-лятов A. ochraceus проводилась на зерне риса (27, 28), а некоторые виды грибов были дифференцированы по способности к накоплению ЭМО (29), ЦПК (30, 31) и МФК (32) при культивировании изолятов на сусловом агаре (СА). Для токсинообразующих представителей трех видов из исследовательской коллекции при прочих равных условиях (7 сут, 23 ° С) нами были испытаны СА, ЧДА и увлажненное зерно риса (ЗР) (табл. 2). Во всех случаях продуцирование ЦПК ( A. flavus ) и МФК ( A. pseudoglaucus и A. repens ) на рисе и ЧДА было сходным, тогда как на СА образование ЦПК изолятами A. flavus оказалось гораздо слабее.

2. Токсинообразующая способность изолятов грибов рода Aspergillus , выделенных из зерновых кормов на сусловом агаре (СА) , агаре Чапека-Докса (ЧДА) и увлажненном зерне риса (ЗР) (23 ° С, 7 сут)

Вид гриба (число изолятов)	Микотоксин	Количество микотоксина, X ±s нг/г субстрата
		СА        ЧДА        ЗР

A. flavus (6) ЦПК 125±28 1410±280 900±165 200±80 1780±40 1710±200 330±55 1190±110 1055±270 93±15 205±83 200±45 945±245 780±195 260±78 810±155 1115±180 A. pseudoglaucus (2) МФК не опр. 970±69 1425±95 не опр. 775±46 1040±56 A. repens (3) МФК не опр. 975±155 1145±150 не опр. 1060±145 1560±190 не опр. 2560±335 3005±920 Примечание. ЦПК — циклопиазоновая кислота, МФК — микофеноловая кислота; X — среднее арифметическое значение, s — ошибка выборочной средней. Прочерк означает, что микотоксин не обна- ружен, не опр. — определение микотоксина не проводилось.

Учитывая различия в метаболическом ответе грибов на СА, последующее тестирование изолятов из сена и соломы мы проводили на двух питательных средах — СА и ЗР (табл. 3), ранее использованном для грибов рода Fusarium из тех же объектов (9). В число анализируемых микотоксинов были введены АВ1, СТЕ, ОА, ЭА, продуцированию которых грибами Aspergillus посвящено большое число работ (35), изученные в меньшей степени МФК, ЦПК и ЭМО (29-32), а также ФУМ и ДОН, найденные у отдельных штаммов этих грибов (33, 34). Из 5 распространенных видов, а также A. nidulans было выбрано по 3-4 культуры, для встречающихся реже — все полученные изоляты (от 1 до 5). У A. candidus и A. niger, выделенных из кормов и входящих в группу патогенных, способность к образованию анализируемых микотоксинов не была обнаружена, поэтому их не включили в дальнейшее иссле- дование. Выбор двух ростовых сред для тестирования токсинообразования грибов оказался удачным. На ЗР происходило более активное накопление большинства микотоксинов — СТЕ (A. versicolor, A. nidulans), ЦПК (A. tamarii, у всех 5 изолятов продуцирование удалось выявить только на этом субстрате) и ЭМО (A. sydowii). Напротив, для биосинтеза МФК у A. pseudoglaucus и A. repens предпочтительнее оказался СА. По результатам оценки грибов Aspergillus относительная ошибка выборочной средней при 3-кратной повторности в посевах на СА и ЗР не превышала 20 % и была вполне приемлемой.

3. Токсинообразующая способность изолятов грибов рода Aspergillus , выделенных из грубых кормов на сусловом агаре (СА) и увлажненном зерне риса (ЗР) (23 ° С, 7 сут)

Вид гриба ( n )	Микотоксин ( n+ )	Количество микотоксина, X ±s нг/г субстрата
		СА	ЗР
A. versicolor (3)	СТЕ (3)	1060±150	197860±30560
		160±32	41620±6520
		4050±810	223960±43310
A. pseudoglaucus (4)	МФК (4)	30320±5620	21730±4340
		1750±130	685±44
		1840±45	630±75
		2200±310	940±22
A. wentii (3)	МФК (1)	123±22
A. nidulans (3)	СТЕ (3)		21460±4200
			9480±1830
			13570±2330
A. tamarii (5)	ЦПК (5)		3410±680
			1920±255
			1370±105
			2780±550
			1760±270
A. sydowii (3)	ЭМО (2)		120±18
			245±45
A. repens (2)	МФК (2)	1020±42	480±27
		810±98	595±80

П р и м е ч а н и е. СТЕ — стеригматоцистин, ЦПК — циклопиазоновая кислота, МФК — микофеноловая кислота, ЭМО — эмодин; n — число исследованных изолятов, n⁺ — число изолятов-продуцентов; X — среднее арифметическое значение, s — ошибка выборочной средней. Прочерки означают, что микотоксин не обнаружен.

Проведенные исследования показали, что выделенный из грубых кормов комплекс грибов рода Aspergillus , включающий 7 видов, способен к биосинтезу СТЕ, ЦПК и МФК. Продуцентами ЦПК были оба представителя группы A. flavus ( A. flavus , A. tamarii ), СТЕ — A. versicolor и A. nidulans , МФК — A. pseudoglaucus , A. repens и A. wentii . При микотоксикологическом анализе сена и соломы из тех же регионов выявлена обширная контаминация СТЕ, МФК, ЦПК и ЭМО со случаями накопления значительных количеств (7, 8). Возможный источник контаминации кормов ЭМО среди грибов рода Aspergillus найти не удалось. Только два из трех изолятов A. sydowii продуцировали его в малых количествах 120±20 и 245±40 нг/г. A. fumigatus , в составе метаболома которого описаны ЭА и ЭМО (36), был представлен единственным изолятом, не способным к образованию ЭМО и продуцирующим ЭА в количестве 220±32 нг/г. ОА, ФУМ и ДОН в образцах мицелиально-споровой биомассы грибов обнаружены не были. АВ₁ сопутствовал СТЕ у двух изолятов A. versicolor , выращенных на ЗР, в следовых концентрациях 15±3 и 14±1 нг/г. Представители распространенных в кормах видов A. amstelodami и A. ochraceus , а также редко встречающихся A. terreus и A. chevalieri не образовывали ни один из изученных микотоксинов в количествах, превышающих десятки нг/г субстрата.

Признавая возможность участия в контаминации этих кормов токсинопродуцирующих видов Aspergillus, нельзя не отметить, что по принятым критериям (37) они в основном относятся к слабым продуцентам — накопление токсинов даже в наиболее благоприятных условиях не достига- ло 10000 нг/г субстрата у всех изолятов A. pseudoglaucus и A. nidulans и было на порядок ниже у A. flavus и A. tamarii. Только один из часто встречающихся видов, A. versicolor, проявил себя в экспериментах как высокоактивный продуцент СТЕ при культивировании на ЗР. Возможно, к контаминации кормов этими же токсинами имеют отношение грибы другой систематической принадлежности, в частности из рода Penicillium. В предыдущих исследованиях были получены указания на то, что многие токсины способны образовывать не только представители Aspergillus, но и грибы других родов (38, 39), поэтому в свете современных представлений понятие «аспергиллотокси-ны» становится все более условным. Развитие геномного анализа показывает, что кластеры, кодирующие биосинтез какого-либо конкретного микотоксина, действительно встречаются у грибов генетически удаленных групп (33).

В настоящей работе получены сведения о способности грибов Aspergillus из микобиоты грубых кормов к токсинообразованию, хоть и не всегда значительной. Тем не менее, вполне возможно, что реализация их потенциала могла приобретать другую интенсивность не только in vivo в процессе вегетации трав, но и после скашивания, высушивания и хранения корма. Изучение причин резких смещений метаболического профиля у грибов под влиянием условий обитания, отмеченных для отдельных са-нитарно значимых видов, в частности для Fusarium graminearum Schw., остается важным направлением научного поиска.

Таким образом, для 7 видов рода Aspergillus получено подтверждение возможности участия в обширной загрязненности кормов циклопиа-зоновой кислотой, стеригматоцистином и микофеноловой кислотой со случаями накопления значительных количеств. Однако источники контаминации другими токсинами, в частности эмодином, охратоксином А, эр-гоалкалоидами, вполне могли быть среди представителей остальных идентифицированных видов, а также среди тех, видовая принадлежность которых не была установлена. Из-за малого числа доступных изолятов нам вряд ли удалось в полной мере оценить токсинообразующую способность A. tamarii , A. sydowii , A. fumigatus , а также A. terreus и A. chevalieri. Вполне возможно, что для A. amstelodami и A. ochraceus выбранные субстраты оказались не вполне подходящими для индуцирования процессов токсинообразова-ния. В этой связи в дальнейшем целесообразно расширить поиск носителей токсичности среди этих видов Aspergillus и других микромицетов из состава микобиоты грубых кормов, а также продолжить эксперименты с тестированием на разных средах для исчерпывающей оценки потенциала грибов.