Виртуальный скрининг и структурная кластеризация потенциальных ингибиторов PARP1

Поли(АДФ-рибоза)полимераза 1 (PARP1) является ключевым ферментом системы репарации однонитевых разрывов ДНК и играет центральную роль в поддержании геномной стабильности. Механизм действия PARP1 протекает следующим образом. PARP1 активируется при обнаружении одноцепочечных разрывов и связывается с участками повреждения посредством своего ДНК-связывающего домена. После связывания с поврежденной ДНК PARP1 увеличивает свою каталитическую активность, использует НАД+ для образования полимеров по.ли-(АДФ-рибозы) (PAR) и переносит их на акцепторные белки [1]. Это поли-АДФ-рибозилирование служит сигналом для других белков к перемещению к месту повреждения ДНК, запуская комплекс репарации. После АДФ-рибозилирования PARP1 претерпевает молекулярные изменения, которые в конечном итоге приводят к снижению его сродства к ДНК. Он высвобождается, «открывая» хроматин и предоставляя доступ к поврежденной области белкам комплекса репарации, который включает такие белки, как ARH3 (Lig3 (ДНК-лигаза 3), pol (3, XRCC1, BRCA1/2 и другие. При инициации комплекса репарации PAR связывает белок XRCC1. PAR регулирует связывание гистона Н1 с хроматином, тем самым ослабляя уплотнение хроматина. Затем фермент поли(АДФ-рибоза)-гликогидролаза (PARG) удаляет поли(АДФ-рибоза)-полимер из PARP, тем самым реактивируя его. Большое количество данных указывает на первостепенное участие PARP1 в канцерогенезе. Канцерогенез сопровождается накоплением большого числа мутаций, полученных в результате одноцепочечных разрывов. Потеря активности PARP1 приводит к нарушению процесса репарации ДНК в онкоклетках и ингибированию транскрипции некоторых генов, участвующих в репликации ДНК и регулировании клеточного цикла [2]. Совокупность этих факторов приводит к утверждению, что ингибирование PARP1 является действующей стратегией в лечении некоторых видов новообразований. Несмотря на наличие применяемых в клинике ингибиторов PARP1, сохраняется высокий интерес к разработке новых соединений с улучшенными фармакологическими характеристиками и повышенной ингибирующей активностью. На сегодняшний день одним из наиболее широко используемых представителей класса PARP1 ингибиторов является олапариб (рис. 1), одобренный FDA для терапии опухолей, ассоциированных с мутациями в генах BRCA1/2 [3]. Олапариб продемонстрировал значимую клиническую эффективность, в том числе способность индуцировать синтетическую летальность за счет подавления репарации одноцепочечных разрывов ДНК в клетках с нарушенной гомологичной рекомбинацией.

Однако, несмотря на успех олапариба и других ингибиторов первого поколения, остаётся ряд факторов, определяющих необходимость поиска новых веществ. В первую очередь эффективность существующих препаратов ограничена их фармакокинетическим профилем, проницаемостью, способностью накапливаться в опухолевых тканях и особенностями метаболической стабильности. Известно, что часть пациентов демонстрирует первичную или приобретенную резистентность к лечению олапарибом, что может быть связано с изменениями в путях репарации ДНК, восстановлением функции BRCA, повышенной экспрессией транспортеров лекарственных веществ или модификациями в структуре

PARP1 [4]. В совокупности эти факторы обосновывают необходимость активного поиска hobbix высокоактивных ингибиторов PARP1 и стимулируют применение современник методов компвютерного моделирования, виртуального скрининга и анализа структурного разнообразия химических библиотек. Поэтому остаётся актуальной задача создания молекул, способных обеспечивать более сильное и устойчивое ингибирование, что потенциально может повысить терапевтическую эффективность и уменьшить частоту развития лекарственной резистентности. Виртуальный скрининг, включающий молекулярный докинг и оценку энергии связывания, позволяет эффективно исследовать большие химические библиотеки и выявлять соединения, способные к специфическому взаимодействию с активным центром PARP1. Однако высокая структурная избыточность библиотек затрудняет выбор уникальных представителей химических пространств. Применение методов структурной кластеризации обеспечивает сокращение числа кандидатных молекул путем выделения репрезентативных структурных групп, что улучшает точность отбора и уменьшает нагрузку на последующий отбор структур для исследований in vitro.

Рис. 1. Структурная формула Олапариба

2.    Материалы и методы

Для молекулярного докинга была использована кристаллическая структура PARP1 в комплексе с лигандом Олапарибом, полученная из базы данных Protein Data Bank [5] (PDB 7KK4). Структура была предварительно подготовлена с помощью Protein Preparation Wizard [6]: удалены кристаллизованные молекулы растворителя, добавлены отсутствующие атомы боковых цепей и водороды. Протонные состояния аминокислот были определены на физиологическом pH = 7,4 с использованием стандартных алгоритмов оптимизации водородных сетей. Для скрининга использовалась химическая библиотека лигандов ChemDiv. Молекулы были стандартизированы с помощью LigPrep [7]. Молекулярный докинг проводился с использованием широко применяемого программного обеспечения Glide [8-11]. Размер области докинга определялся на основании положения ко-кристаллизованного ингибитора. Обязательным условием для докинга являлось наличие водородных связей с ключевыми аминокислотными остатками катализаторного домена глицин 863 и серин 904. Для каждого соединения рассчитывались значения docking-score. Соединения, попавшие в верхний процентиль распределения docking-score, были отобраны для последующего структурного анализа. Впоследствии соединения были подвергнуты кластеризации по структурной схожести. Для этого использовались fingerprints и метрика Танимото, представленные в библиотеке rdkit [12]. Кластеризация проводилась методом Бутина. Из каждого кластера выбирались лучшие репрезентативные соединения, обладающие наилучшим docking-score.

3.    Результаты и обсуждение

После проведения виртуального скрининга и первичного отбора по значению dockingscore была выполнена структурная кластеризация полученных структур. Всего было проанализировано 4087 молекул, распределенных на 1314 кластеров при пороговом расстоянии 0.20. Такое значение отсечки позволило добиться высокой однородности внутри одного кластера: среднее сходство между двумя случайно выбранными молекулами внутри одного кластера составило 0.98, что указывает на выраженную структурную консервативность. В то же время межкластерное сходство оставалось низким (0.25), что подтверждает корректное разделение химического пространства на непересекающиеся структурные группы. Наибольший кластер включал 125 молекул, что указывает на существование доминирующего фрагментного мотива, представленного множеством близких по структуре аналогов. Кроме того, было выявлено 20 кластеров, содержащих более 25 молекул каждый (рис. 2).

• •    Cluster 1 (П=125)

Cluster 2 (п=116)

• •    Cluster 3 <п=112)

Cluster 4 (п=1081

• •    Cluster 5 <п=94)

Cluster 6 (п=92)

• •    Cluster 7 (п=82)

Cluster 8 (п=64)

• •    Cluster 9 <п=4Э1

Cluster 10 (п-41)

• •    Cluster 11 in=40) * Cluster 12 (n=32)

• •    Cluster 13 (n=32)

Cluster 14 h=31) « Cluster 15 |n=30)

Cluster 16 ln=30|

• •    Cluster 17 (n=29)

Cluster IB tn=?7>

• •    Cluster 19 [n=27J

Cluster 20 |n=26)

UMAP: кластеры с размером > 25

О                   5                   10                  15                  20

UMAP 1

Рис. 2. Карта сходства для полученных кластеров, содержащих более 25 структур, визуализиро-ваипая с помощью алгоритма UMAP

Для последующего анализа в кластерах с числом структур более пяти отбирались пять соединений с наилучшим значением docking-score. Если кластер включал менее пяти молекул, в выборку включались все доступные представители. В результате данной фильтрации из 1314 кластеров были отобраны 2412 молекул. Эта стратегия позволила сохранить баланс между структурным разнообразием и высокой вероятностью релевантного связывания с активным центром PARP1. Репрезентативный набор включал как молекулы из крупных кластеров, так и соединения из малых групп, что позволяет оценивать как крупные химические группы, так и единичные перспективные структуры. Отобранные 2412 молекул были повторно проанализированы с точки зрения их docking-score. Соединения из крупных кластеров демонстрировали схожие паттерны связывания, что отражает их структурную близость. В то же время среди небольших кластеров были идентифицированы уникальные взаимодействия, которые могут представлять интерес для дальнейшего развития новых химических классов. Комплексный анализ позволил выделить репрезентативный набор из 2412 соединений, отражающих структурное разнообразие всей библиотеки. Часть структур представлена на рис. 3. Кластеризация с высоким внутригрупповым сходством и последующий отбор топ-структур по docking-score обеспечили рациональный, статистически обоснованный переход от большого химического пространства к управляемому набору исходных кандидатов.

Еще одним немаловажным выводом может послужить то, что использованная для скрининга библиотека представляет собой хорошо сбалансированный набор молекул, включающий как крупные структурные серии, так и уникальные структуры, которые были включены в малые кластеры. Библиотека обладает высокой информативностью и является перспективной основой для последующих этапов скрининга — включая более углубленный анализ; также она может быть эффективно использована для уточнения SAR-зависимостей, идентификации ключевых фармакофорных фрагментов и отбора наиболее перспективных химических направлений для дальнейшей hit-to-lead оптимизации. Полученные нами результаты подтверждают, что сочетание виртуального скрининга, кластеризации и прицельного отбора по метрикам является эффективным подходом для выявления новых потенциальных ингибиторов PARP1 и может служить основой для дальнейших стадий исследований.

Рис. 3. Примеры полученных в результате виртуального скрининга и последующей кластеризации структур потенциальных ингибиторов PARP1

4.    Заключение

В данной работе представлены виртуальный скрининг библиотеки Chemdiv в кристаллической структуре PARP1 в комплексе с ингибитором и последующая структурная кластеризация полученных соединений. На основе анализа кластеров были отобраны структуры, демонстрирующие наиболее благоприятные значения docking-score. Проведенное исследование продемонстрировало эффективность комплексного подхода, сочетающего в себе виртуальный скрининг и структурную кластеризацию, для поиска перспективных высокоактивных селективных ингибиторов PARP1. Скрининг библиотеки позволил выделить множество потенциальных хитов, а их последующая группировка по структурной схожести обеспечила рациональный выбор репрезентативных соединений для последующего in vitro анализа. Полученные данные подтверждают, что предложенная стратегия может быть полезной для первичного отбора новых лекарственных кандидатов, ориентированных на определенную мишень.

5.    Финансирование

Это исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Госзадание), соглашение 075-03-2024-117, проект № FSMG-2024-0049.

6.    Заявления об этичности