Вирулентность клубеньковых бактерий сои и масштабы усвоения симбиотического азота в почвах Приамурья

Введение. В почвах Дальнего Востока масштабы использования симбиотического азота в посевах сои достигают 50–70 % от общей потребности в элементе [4; 5].

Указанные процессы определяются взаимодействием аборигенной популяции ризобий с сортами сои преимущественно амурского происхождения. Массовое образование клубеньков на корнях сои в лугово-черноземовидных, луговых глеевых и других почвах Приамурья свидетельствует о высокой агрессивности изучаемых ризобий – их вирулентности, активности, конкурентоспособности и эффективности [2]. Вместе с тем во многом остаются неясными факторы, определяющие сортовую специфику и динамику симбиотиче- ской азотфиксации. Исходя из этого, представлялось важным проанализировать свойства вирулентности аборигенных штаммов клубеньковых бактерий по отношению к местным и инорайонным сортам сои и определить у отдельных сортов показатели потребления симбиотического азота.

Материалы и методы. С этой целью в течение длительного времени (1980– 2010 гг.) проводились исследования на лугово-черноземовидных почвах Дальнего Востока. Указанные почвы имеют гумусовый горизонт мощностью 25–30 см, содержание гумуса 4–5 %, реакция среды от слабо кислой до нейтральной, pH солевое - 5,1, сумма поглощённых оснований 25-40 мг-экв. на 100 г почвы. Содержание валового азота от 0,3 до 0,5 %, фосфора – 0,2-0,3, калия - 2-2,5 %.

Территория, на которой располагались опыты, характеризуется чертами муссонного климата. Сумма активных температур колеблется от 1700 до 2100 °С, годовое количество осадков до 600 мм. За тёплый период выпадает 300–450 мм. Распределение гидротермических ресурсов крайне неравномерно по месяцам. Продолжительность безморозного периода 120-125 дней.

Изучались сорта амурской селекции, включая Амурскую 310, Октябрь, Гармонию, Негу и ряд других.

Количество клубеньков учитывали при отборе среднего образца на экспериментальных участках по общепринятой методике в расчёте на 1 растение. Показатель вирулентности определяли по соотношению количества растений, образовавших клубеньки, в общей выборке. В лабораторных опытах вирулентность штаммов определяли при выращивании растений в ёмкостях со стерильной средой Гельриге-ля с уменьшенной дозой азота [8; 9; 10]. Долю использования растениями биологического азота учитывали методом Тре-пачева Е.П. [7] при сравнении с небобовой культурой (овсом). Одновременно этот же показатель рассчитывали мето- дом Бегуна С.А. [3] путём сравнения содержания азота у изучаемого сорта и его мутанта-сортообразца с неэффективным симбиотическим аппаратом (скудно растущая соя).

Результаты и обсуждение. В изучаемых почвах в течение длительного естественно-исторического отрезка времени сформировалась популяция специфичных для сои клубеньковых бактерий, что явилось результатом длительной коэволюции макро- и микросимбионтов. Это подтверждается повсеместным распространением в рассматриваемом регионе диких форм сои. Изучаемые ризобии, по-видимому, обладают достаточным разнообразием свойств и разделяются на виды ( Bradyr-hizobium japonicum и Sinorhsobium fredii ), включая кластеры, клональные и штам-мовые структуры.

После масштабного расширения посевов селекционных сортов сои на Дальнем Востоке на популяцию аборигенных клубеньковых бактерий стали оказывать дополнительное давление генотипы культурных растений, включая сорта инорайонного происхождения. Естественно, что одним из наиболее информативных показателей уровня взаимоотношений партнёров симбиоза является образование клубеньков на корнях. Он характеризует вирулентность штаммов - их способность проникать в ткань корня и вызывать образование клубеньков [6]. В какой-то мере этот же показатель может характеризовать и конкурентоспособность изучаемых объектов, хотя в большей степени данный признак обусловлен, по-видимому, достаточно сложными биохимическими процессами взаимодействия партнёров симбиоза.

В соесеющем поясе Приамурья повсеместно в массовых посевах на корнях сои наблюдается образование значительного количества клубеньков, что свидетельствует об их высокой вирулентности. Вместе с тем по отношению к сортам растения-хозяина выявлены заметные отклонения. Как видно из таблицы 1, число клубеньков не всегда зависит от места происхождения сорта. У китайского сорта Хэйхэ 1 и амурского сорта Дочь Крапинки количество клубеньков различается несущественно.

Таблица 1

Влияние амурской популяции ризобий на образование клубеньков различных сортов сои (среднее за 4 года)

Сорта сои	Фаза
	начало цветения		полное цветение
	масса клубеньков, мг на раст., сух. в-ва	количество клубеньков на 1 раст.	масса клубеньков, мг на раст., сух. в-ва	количество клубеньков на 1 раст.
Октябрь 70	81 ± 15	33 ± 6	-	-
Хэйхэ 1	128 ± 32	51 ± 12	368	90
Кобра	77 ± 19	29 ± 10	362	88
Восход	100 ± 4	33 ± 6	-	-
Дочь Крапинки	93 ± 3	48 ± 9	-	-
Усреднённый показа тель	96	39

Развитие клубеньков в период начала цветения зависит в основном от темпов прироста надземной массы растений.

В период полного цветения указанные признаки в вариантах с контрастными показателями (сорта Хэйхэ 1 и Кобра) выравниваются. Это даёт основание считать, что в почвенной среде, где популяция ри-зобий сои представлена достаточно разнообразным штаммовым составом, партнёры симбиоза в основном комплиментарны. Кроме того, в данном случае процесс образования клубеньков в наибольшей степени определяется гидротермическими и другими экологическими факторами. Следовательно, первичными в такой ситуации являются исходные возможности развития растения-хозяина.

В отличие от этого, при взаимодействии чистых культур ризобий со стерильными растениями в стерильной агаризо-ванной среде, показатель вирулентности зависит от физиолого-биохимических взаимодействий (табл. 2).

При определении вирулентности двух аборигенных штаммов ризобий сои (медленнорастущий 648-а и быстрорастущий

БД-32) выявлены существенные различия данного признака. По отношению к 8 из 14 испытываювшихся сортов вирулентность штамма 648-а составила 93–100 %.

Таблица 2

Показатели вирулентности амурских штаммов ризобий по отношению к различным сортам сои, лабораторные опыты

(среднее из 4-х опытов)

Название сорта	Происхождение сорта	Количество клубеньков на 1 растении		Вирулентность, %
		в сред нем	lim	штамм 648 а, медленно-растущий	штамм БД-32, быстро-растущий
Омская 4	г. Омск	5,7	3–9	100	54
Хабаровская 117	г. Хабаровск	4,0	1–8	100	40
Хабаровская 4	г. Хабаровск	7,1	2–11	100	67
Кобра	г. Хабаровск	3,5	2–5	82	47
Восход	г. Ершовск	2,2	0–4,5	100	0
Крепыш	респ. Крым	7,9	4,5–13	100	100
ВНИИС 1	Амурск. обл.	2,9	1–5	93	45
Рассвет	Амурск. обл.	4,6	1,5–8	100	70
Октябрь 70	Амурск. обл.	4,4	2–6	100	64
Дочь Крапинки	Амурск. обл.	4,5	2–6	93	83
Вега	Амурск. обл.	2,0	2–2	73	54
Хэйхэ 1	Китай	5,8	5–6	93	78
Хэйхэ 3	Китай	2,7	2,5–3	77	69
Соната	Амурск. обл.	6,9	3–11	93	68
Средний показатель	-	4,58	-	93,1	60,2

Этот же показатель у быстрорастущей формы в среднем оказался на 35 % ниже. Наиболее восприимчивым к обеим бактериальным формам является сорт Крепыш. По отношению к сортам Кобра, Вега, Хэйхэ 3 вирулентность первого штамма достигает 73–82 %. На этих же сортах минимальную вирулентность проявил и быстрорастущий штамм. Существенные колебания изучаемого показателя по отношению к некоторым сортам свидетельствуют о наличии определённых механизмов, препятствующих нодуляции. Возможно и проявление внутрисортовой разнокачественности семян. Такая разно-качественность может отражаться на биохимических свойствах корневых выделений прорастающих семян.

В свою очередь, при реализации симбиотических взаимоотношений на корневую систему действует Nod-фактор, про-63

дуцируемый ризобиями. Специфичность действия Nod-фактора определяется сигнальными молекулами, которые способствуют одновременно инфицированию корней и симбиоорганогенезу [11]. При первоначальном контакте сигнальных молекул и поверхности корней искривляются корневые волоски. Наблюдается подщелачивание цитоплазмы, колебания концентрации ионов К в клетках эпидермиса и деполяризация мембран.

По данным А. Хадри и Т. Бисселинга [12], Nod-фактор состоит из молекул хитиноподобного скелета, к которому присоединяется остаток жирной кислоты. Длина и степень ненасыщенности молекул жирной кислоты значительно варьирует. Это отражается на специфичности реакции симбионтов и, в конечном итоге, на уровне вирулентности.

Аналогичными причинами можно объяснить различия в показателях вирулентности медленно- и быстрорастущих штаммов. За время исследований было выделено 96 штаммов вида B. japonicum и 64 штамма вида S. fredii . Их вирулентость в среднем различалась более чем на 30 % (табл. 3).

Таблица 3

Вирулентность медленнорастущих и быстрорастущих штаммов ризобий сои, выделенных из почв Приамурья

Группы штаммов	Количество штаммов	Вирулентность
		%	lim
Медленнорастущие Bradyrhizobium japonicum	96	86,3	70–100
Быстрорастущие Sinorhisobium fredii	64	67,3	0–100

По данным Бегуна С.А. и др. [1], в лугово-черноземовидных почвах доля штаммов B. japonicum составила 72 % и доля штаммов S. fredii – 28 % от общего количества бактериальных форм указанных видов.

Можно полагать, что в такой же пропорции изучаемые штаммы (в зависимости от свойств) воздействуют на процессы симбиотической азотфиксации.

Как видно из таблицы 4, доля использования соей азота атмосферы у изучаемых сортов различается несущественно. По усреднённым данным при применении двух методов учёта сорт Гармония за два срока наблюдений использовал 77 % симбиотического азота, а сорт Нега – 74,5 %. Применявшиеся два метода определения доли фиксированного клубеньками атмосферного азота (метод сравнения с небобовой культурой и метод сравнения исходного сорта с его же формой-мутантом, образующим незначительное количество клубеньков низкой активности) продемонстрировали высокую сходимость результатов.

Таблица 4

Доля усвоения растениями сои атмосферного азота (%), определённого методами сравнения с небобовой культурой (овсом) и сортообразцом сои с неактивными клубеньками

Сорт, период вегетации	Фаза развития	Метод определения связанного азота в сравнении		Среднее по методам определения	Масса сухого вещества в конце цветения, г/раст.
		с овсом	с соей с неактивными клубеньками
Гармония, 100–108 дней	Цветение	78,0	77,0	77,5 ± 0,5	12,7
	Созревание	76,0	73,0	74,5 ± 1,5
	Среднее за две фазы	77,0	75,0	76,0 ± 1,0
Нега 1, 110–116 дней	Цветение	82,0	82,0	82,0 ± 0	13,9
	Созревание	67,0	63,0	65,0 ± 2,0
	Среднее за две фазы	74,5	72,5	73,5 ± 1,0
НСР 05					2,0

Можно отметить, что по масштабам использования фиксированного азота, некоторое преимущество имеет сорт Гармония. Особенности данного процесса достаточно заметно выявляются по фазам развития. Следовательно, сортовая спе- цифика усвоения симбиотического азота зависит в основном от темпов развития растений по фазам вегетации и от продолжительности вегетационного периода.

Выводы. 1. Клубеньковые бактерии сои, обитающие в лугово-черноземовидных почвах Приамурья, способствуют массовому образованию клубеньков и характеризуются высоким уровнем вирулентности ко всем испытывавшимся сортам. Вне зависимости от географического происхождения на корнях сои в изучаемых условиях в середине вегетационного периода образуется от 29 до 90 клубеньков в расчёте на 1 растение.

• 2.    Вирулентность аборигенных штаммов ризобий сои в различных факториальных сочетаниях составляет от 45 до 100 %. По отношению к сортам сои различного географического происхождения чётких различий по вирулентности не выявлено. Минимальные значения данного показателя установлены для сортов Восход, ВНИИС 1, Кобра.

• 3.    Штаммы быстрорастущего вида ри-зобий сои S. fredii обладают меньшей вирулентностью по сравнению со штаммами вида B. japonicum . Данный показатель составляет соответственно 40–100 и 73– 100 % применительно к изучавшимся сортам.

• 4.    Доля использования симбиотического азота амурскими сортами Гармония и Нега 1 по усреднённым данным составляет 72,5–77,0 %. Сортовые различия выявляются в зависимости от фазы вегетации и продолжительности вегетирования.

• 5.    Определение доли использования соей симбиотического азота методом сравнения с небобовой культурой (овсом) и методом сравнения исходного сорта с его же формой-мутантом, образующим незначительное количество клубеньков низкой активности, продемонстрировали высокую сходимость результатов в обе изучаемые фазы развития растений: соот-

• ветственно 78–77 %…76–73 % и 82–82 %... 67–63 %.