Вискозиметрическое определение эндоглюканазной активности ферментных кормовых добавок

В настоящее время для животноводства разработано множество ферментных добавок, применяемых для снижения антипитательности кормов. Ферменты, позволяющие расщеплять компоненты растительного происхождения (цитолитические ферменты — ксиланазы, глюканазы, целлюлазы) добавляют в корма моногастричных животных, в том числе птицы, у которых некрахмалистые остовые полисахариды (целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнин, пектин) плохо усваиваются. Повышенное содержание растворимых некрахмалистых полисахаров — гемицеллюлоз (глюканов и ксиланов) вызывает высокую вязкость кормовой массы, особенно при использовании свежесобранного урожая или в засушливые годы. Широкое внедрение препаратов целлюлаз и гемицеллюлаз, наблюдаемое в последнее время, связано с тем, что кукурузу в рационах заменяют зерновыми (ячменем, рожью, пшеницей, овсом, тритикале, а также шротами и жмыхами), и с увеличением содержания некрахмалистых полисахаридов в кормах. Активность таких добавок зарубежные фирмы-производители определяли с использованием собственных методик (Rovabio, BASF, Biovet AD, Kemin). У потребителей это вызывает за- труднения, так как не удается сравнить действие разных ферментных кормовых добавок между собой и с заявленным производителями аналогичной по назначению продукции (1-3).

В 2012 году в России были разработаны межгосударственные стандарты, регламентирующие определение β -ксиланазной и целлюлазной активности ферментных кормовых добавок (ГОСТ 31488, ГОСТ 31662), а с 1 июня 2013 года введен в действие национальный стандарт (ГОСТ Р 54905-2012), описывающий унифицированную методику определения активности экзоглюканазы. Однако в последнее время все больше иностранных фирм и лабораторий переходят на использование методов измерения эндо- β -глюканазной активности, что связано с потребностями кормопроизводства.

Именно эндоглюканазы позволяют уменьшать вязкость химуса при его прохождении через желудочно-кишечный тракт моногастричных животных, в частности свиней и сельскохозяйственной птицы (4, 5), а также молодняка крупного и мелкого рогатого скота. Способность ферментов, вносимых в корма извне, разрывать углеводные полимеры на более мелкие фрагменты позволяет решать задачи по повышению усвояемости некрахмалистых полисахаридов типа целлюлоз и гемицеллюлоз, которые практически не расщепляются гликолитическими ферментами животных. Добавки ферментов позволяют шире использовать зерновые рационы как источники энергии для сельскохозяйственной птицы и свиней (6, 7). Существует более 60 энзимных препаратов с разным типом активности, которые считаются авторизованными (8-11). Тем не менее, для них не установлены единые способы оценки и сравнения действия, что создает проблему для осуществления контроля за их производством и применением (12).

Описанные методы можно разделить на две группы — вискозимет-рические и колориметрические (13). Вискозиметрические методы обеспечивают прямое измерение активности, поскольку основаны на определении скорости уменьшения вязкости субстрата-полисахарида. Колориметрические методы косвенные, и в этом случае принцип заключается в гидролизе ферментом окрашенных субстратов (полисахаридов) с отщеплением хромофора и определении развивающейся при этом окраски. Результаты колориметрических определений приходится оценивать в собственных единицах (единицы оптической плотности — ед. ОП) или пересчитывать в единицы, принятые для измерения экзоглюканазной активности (ГлА) в эквиваленте по глюкозе с ферментом-стандартом. Однако, поскольку единого стандартного метода определения активности эндоглю-каназы не существует, декларируемая активность стандартного фермента зависит от фирмы-производителя (в том числе от метода определения активности и специфичности фермента). Поэтому из двух подходов, по нашему мнению, вискозиметрия более перспективна для стандартизации приемов исследования эндоглюканазной активности и получения сопоставимых результатов и используется в ряде лабораторий (14-16). При выполнении вискозиметрического исследования за единицу активности принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях гидролиза β -глюкана приводит к увеличению относительной текучести субстрата, равному 1 мин ^{- 1}.

Таким образом, в Российской Федерации ранее не существовало стандартизованных методик определения активности эндо-β-глюканазы в ферментных препаратах для животных, что создавало трудности при регистрационной экспертизе этой группы кормовых добавок и разработке регламентов их применения. Нами впервые оптимизирована методика вис- козиметрического определения действия фермента, основанная на оценке измерения относительной текучести субстрата с использованием капиллярного вискозиметра.

Нашей целью была разработка метода, позволяющего стандартизировать определение эндо- β -глюканазной активности в ферментных препаратах, применяемых в качестве добавок к кормам для снижения их антипитательности.

Описание методики . Вязкость образцов исследовали с использованием методики вискозиметрического определения (17) в нашей модификации. Определяли относительную вязкость (текучесть) субстрата на капиллярном вискозиметре Оствальда с диаметром капилляра 0,73 мм по скорости истечения жидкости (вискозиметр истечения) в сравнении с растворителем (ацетатный буфер, рН 4,7) при 30 ° С. Растворитель заливали в вискозиметр, выдерживали при 30 ° С в течение 5 мин, после чего пропускали его последовательно 3-5 раз, чтобы определить среднее время истечения ( t_p ). Затем вискозиметр освобождали от растворителя, вносили в него пипеткой 8 см³ субстрата и 1 см³ буферного раствора (определенный объем для каждого вискозиметра; в нашем случае — 9 см³), выдерживали 5 мин при температуре 30 ° С и пропускали смесь 3-5 раз (начальное время истечения т ₀). Вискозиметр снова освобождали, тщательно промывали, высушивали и вносили 8 см³ субстрата. Выдерживали при температуре 30 ° С в течение 5-7 мин, после чего добавляли 1 см³ раствора фермента (образца), который также предварительно прогревали при 30 ° С. Содержимое вискозиметра перемешивали, продувая воздух. С помощью секундомера фиксировали время истечения инкубационной смеси субстрата с ферментом (t i ) в периоды инкубации ( т i ) 5, 10 и 15 мин, что согласуется с данными по кинетике этой ферментативной реакции (M.L. Rabinovich, А.А. Klesov, I.V. Beresin, 1977).

Рассчитывали относительную вязкость инкубируемой смеси для каждого периода инкубации ( т i , в том числе т ₀) по формуле:

П , =

ti

—

t p

t p

где п , — относительная вязкость в период инкубации т i ; t i — время истечения инкубационной смеси в каждый период инкубации, с; t_p — время истечения растворителя, с. На основании полученных значений рассчитывали относительную текучесть как величину, обратную относительной вязкости (1/ η i = b i ).

Для каждого отрезка времени определяли изменение относительной текучести в минуту:

A = (Ь, - Ь^/т,-, мин—1 = Ab/т, мин—1,                       [2]

где b₀ — начальная относительная текучесть (при т ₀).

Эндо- β -глюканазную активность (ед/г) рассчитывали по формуле: А

ЭндоГлА = — ,                              [3]

где А — изменение относительной текучести в 1 мин; С — количество ферментного препарата в реакционной смеси, г.

Величину А определяли как среднюю арифметическую величин A i , полученных для каждого периода инкубации ( т , ) по формуле [2].

Из образца стандарта готовили серию разведений (стандартные растворы) и с ними определяли изменение вязкости (текучести) того же субстрата в реакции гидролиза. Время истечения измеряли однократно после 10 мин инкубации.

дуцент Trichoderma longibrachiatum ) с

Пример градуировочного графика для пересчета данных вискозиметрии в единицы ГлА при оценке эндо- β -глюканазной активности образца по изменению текучести субстрата.

Для выражения эндо- β -глюканазной активности в единицах ГлА в каждой серии определений строили градуиро-1,4 вочный график (рис.).

В качестве стандарта использовали β -глюканазу (проактивностью 3100 ед/г (ед. ГлА)

(«Sigma-Aldrich», США). В дальнейшем пересчитывали данные виско-зиметрического определения (ед/г) в единицы ГлА.

Точность методики оценивали, анализируя аттестованные образцы с разным содержанием β-глюканазы в условиях внутрилабораторной прецизионности со следующими изменяющимися факторами: оператор (¹ 1 и ¹ 2), набор реактивов (¹ 1 и ¹ 2), матрица. Матрицей служили минеральные носители — карбонат кальция (хч, Россия) и цеолит (НПФ «Новь», г. Новосибирск). Активность каждого аттестованного образца рассчитывали по концентрации стандарта (фермента) в аттестованной смеси (в смеси с минеральным носителем). Таким образом, с каждым носителем готовили по 5 образцов с активностью 93, 310, 620, 1033 и 1550 ед. ГлА/г, а с учетом трех факторов по каждой активности было выполнено 8 экспери- ментов (всего 40 измерений) (табл. 1).

1. Схема эксперимента по оценке точности методики, предложенной для стандартизации вискозиметрического определения эндо- β -глюканазной активности образца

Номер эксперимента	Изменяемый фактор
	матрица	набор реактивов	оператор
1	Карбонат кальция	1	1
2	Карбонат кальция	2	2
3	Цеолит	2	2
4	Карбонат кальция	2	1
5	Цеолит	1	2
6	Карбонат кальция	1	2
7	Цеолит	1	1
8	Цеолит	2	1
Примечание. 1 и	2 — варианты изменяемого фактора.

В качестве субстратов испытывали растворы β -глюкана и карбок-симетилцеллюлозы ( КМЦ) (концентрации 0,1-0,5 %) в ацетатном буфере (0,1 M, рН 4,7).

При статистической обработке данных для каждого аттестованного образца с учетом результатов единичных анализов по 8 вариантам определяли средние значения и дисперсию среднего значения S2. На основании полученных величин рассчитывали относительную расширенную неопределенность (%), предел повторяемости (%) и показатели правильности относительной стандартной неопределенности (%).

Определяя оптимальные концентрации субстратов, обращали внимание на время истечения исходного раствора в сравнении с растворителем. При скорости истечения растворителя (буферный раствор) 26-30 с скорость истечения исходных растворов субстратов в испытуемых концентрациях составляла от 40 с (для 0,1 % КМЦ) до 114 с (для 0,5 % β -глю-кана). Оптимальным временем истечения можно признать 60-80 с. При 226

более высоких скоростях (например, как для 0,1 % КМЦ) снижение вязкости смеси в результате действия фермента может привести к уменьшению времени ее истечения до такового у растворителя. При увеличении периода истечения (более 80 с) уменьшается контролируемое время контакта субстрата и фермента.

Исходя из этого, в качестве оптимальных концентраций субстратов мы выбрали для β -глюкана — 0,4 %, для КМЦ — 0,2 % и в дальнейшем использовали их в работе.

Испытание разных субстратов в оптимальных концентрациях показало несоответствие между конечными результатами по вязкости, что связано со спецификой фермента. Эндо- β -глюканаза расщепляет 1,3- и 1,4- β -гликозидные связи в цепи остатков глюкозы и гидролизует по этим связям как глюкан (гемицеллюлозу), так и целлюлозу. По этой причине некоторые авторы используют указанные субстраты как взаимозаменяемые (17, 18), а названия ферментов β -глюканаза и целлюлаза — как синонимы. Оба вещества представляют собой полимеры глюкозы, в которых мономеры соединены связями β -1,3 и β -1,4. Они относятся к некрахмалистым полисахаридам и антипитательным веществам, поскольку не расщепляются ферментами в желудочно-кишечном тракте животных и препятствуют усвоению других питательных компонентов корма.

Однако эти соединения различаются как по составу, так и по физико-химическим свойствам. Глюканы — это гемицеллюлозы с молекулярной массой до 50000 Да и разветвленной структурой. Они растворимы в слабых кислотах и щелочах, содержатся в семенах ячменя, ржи и пшеницы. Целлюлозы представляют собой нерастворимые линейные полимеры глюкозы с молекулярной массой от 50000 до 1800000 Да. Они не растворяются в кислотах и щелочах, входят в состав клеточных стенок злаков. Именно гемицеллюлозы (глюканы и ксиланы) обусловливают вязкость химуса и вызывают основные проблемы с перевариванием и усвоением питательных веществ корма.

Для сравнения влияния субстрата на конечные результаты проводили вискозиметрический анализ эндоглюканазной активности образца Хостазим («Biovet», Болгария). Как показали проведенные исследования, вязкость образца при использовании в качестве субстрата β -глюкана составила 12125±1819 ед/г, а КМЦ — 56500±8475 ед/г.

β -Глюкан позволяет выявлять β -глюканазную активность, в то время как КМЦ дает данные о целлюлазной (точнее, КМ-целлюлазной) активности, которые для одного и того же образца могут значительно различаться. В нашем случае последняя была в 4,5 раза выше, что, видимо, определяется специфичностью фермента, в котором целлюлазная активность преобладает, и зависит от свойств гриба-продуцента.

2. Рассчитанные показатели точности методики, предложенной для стандартизации вискозиметрического определения эндо- β -глюканазной активности образца

	Активность стандартных образцов, ед. ГлА/г
	93        310        620        1033        1550

Относительная расширенная неопределенность при коэффициенте охвата

k = 2, %	22,1	11,3	9,6	12,2	11,3
Предел повторяемости, %	12,8	7,3	13,3	2,6	8,0
Показатель правильности относи-
тельной неопределенности, %	4,6	3,2	3,2	3,4	3,4

В связи с этим в дальнейших испытаниях мы использовали в качестве субстрата только β-глюкан и проводили исследования, варьируя три фактора — оператор, матрица (карбонат кальция и цеолит) и набор реактивов. На основании полученных данных оценили показатели точности методики в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-2002 (24) и РМГ 61-2010 (25) (табл. 2).

Полученные результаты позволяют принять область определения активности эндоглюканазы при использовании вискозиметрического метода, равную 93-1550 ед. ГлА/г (в пересчете на глюканазный эквивалент). Лучшие результаты могут быть получены в диапазоне значений 310-1550 ед. ГлА/г, что соответствует 1240-6200 ед/г в единицах, принятых при виско-зиметрическом методе (расширенная неопределенность 10-12 %).

Таким образом, оптимизированы условия оценки эндо- β -глюка-назной активности кормовых добавок по снижению относительной вязкости (повышения относительной текучести) смеси фермента с субстратом. Для определения используется капиллярный вискозиметр с диаметром капилляра 0,73 мм при температуре гидролиза 30 мин, растворитель — ацетатный буфер с рН 4,7, соответствующим оптимуму действия фермента, при времени анализа 5, 10, 15 мин. В качестве субстрата из двух возможных вариантов ( β -глюкан и карбоксиметилцеллюлоза) выбран раствор β -глюкана в концентрации 0,4 % как наиболее соответствующий специфичности действия фермента. Показана возможность пересчета получаемых данных в единицы β -глюканазной активности с эквивалентом по глюкозе (ед. ГлА) с помощью градуировочных графиков, построенных с использованием стандарта — фермента с известной активностью. Оценены показатели точности разработанной методики. Расширенная неопределенность результатов измерений находится в пределах от 10 до 22 % (10-12 %) при коэффициенте охвата k = 2.