ВЭЖХ анализ новых биологически активных соединений: азометинов, тиенопиримидинов и диметоксихиназолинонов

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 547.855:547.856:615:281                        

Поиск новых биологически активных соединений является актуальным направлением фармации и медицины. В частности это относится к целенаправленному синтезу производных пиримидина и их ациклических предшественников с заданными фармакологическими свойствами [1]. Данные группы органических соединений обладают разнообразными видами фармакологической активности, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных объектов для поиска и создания высокоэффективных и безопасных лекарственных средств [2, 3].

Известно, что азометиновые производные 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида могут обладать антибактериальными свойствами в отношении Slaphylococcus. aureus, Bacillussubtillis, Pseudomonasaeruginosa и Escherichia coli [4]. Они проявляют противораковую активность [5] и оказались эффективными, например, для лечения рака предстательной железы на поздних стадиях заболевания [6]. Для анализируемых в работе азометиновых производных 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида установлена церебропротекторная активность за счет снижения агрегации амилоидных частиц и антихолинэстеразного действия, что делает их перспективными кандидатами для разработки новых лекарственных препаратов против болезни Альцгеймера [7]. Помимо этого они проявляют противовирусную активность в отношении новой коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2) [8]. За счет ингибирования тирозиназы азометины могут применяться для лечения нарушений пигментации кожных покровов человека [9].

Что касается тиенопиримидинов, то, например, некоторые представители тиено[2,3-d]пиримидин-4(1 Н )-онов подавляли рост опухолевых клеток толстой кишки человека [10]. Результаты фармакологического скрининга выявили у 2-замещенных 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3 H )-она способность ингибировать продукцию медиаторов воспаления [11]. Как и их азометиновые предшественники производные тиено[2,3-d]пиримидин-4(3 H )-она показали высокую ингибирующую активность тироизназы [12] и протеаз вируса SARS-CoV-2 [8]. Они также обладают антихолинэстеразным и антиамилоидным действиями, что важно для разработки лекарственных средств обладающих выраженными церебропротекторными свойствами [13].

Имеются литературные данные, указывающие, что производные 6,7-диметоксихиназолинон-4(3 H )-она можно использовать для терапии сердечно-сосудистых заболеваний [14], проявлять гиполипидемическое действие [15], облегчать течение атеросклероза и обладают широким спектром противовоспалительных свойств [16]. Для производного 6,7-диметоксихиназолинон-4(3 H )-она обнаружена ингибирующая активность гистаминового H 1 -рецептора человека, что позволяет его использовать для лечения астмы и аллергии [17]. В ходе исследования in vivo установлено, что представители исследуемых рядов обладают высоким нейропротекторным действием [18].

Таким образом, азометиновые производные 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида и их циклические продукты тиенопиримидины, а также производные 6,7- диметоксихиназолинон-4(3H)-она следует рассматривать в качестве перспективных соединений для дальнейших медико-биологических и химико-фармацевтических исследований.

Одним из этапов разработки норм качества новых активных фармацевтических субстанций является проведение хроматографического анализа с целью разработки методик установления подлинности и чистоты анализируемых соединений, что является целью осуществленных исследований.

Материал и методы исследования

Объектами анализа выступают ранее синтезированные азометиновые производные 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида [7, 19] и соответствующие продукты их циклизации – 2-замещенные 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3 H )-она [12, 13] и производные 6,7-диметоксихиназолин-4(3 Н )-она, содержащие остатки аминокислот и дипептидов [18]. Структурные формулы изучаемых соединений приведены на Рисунок 1 и 2.

Условия определения посторонних примесей в анализируемых образцах посредством ВЭЖХ анализа для азометиновых производных 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида

Хроматограф «Стайер», снабженный УФ-детектором UVV-104M (НПО «Аквилон», Россия). Хроматографическая колонка Luna C18 150 х 4,6 мм (Phenomenex, США) с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и воды для ВЭЖХ в объемном соотношении компонентов 70:30, продолжительность анализа 30 минут, температура колонки 25 °С, объем пробы 20 мкл, длина волны детектирования 210 нм. Для соединения 1k в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты в объемном соотношении компонентов 80:20. В указанных условиях проводили хроматографический анализ синтезированных и исходных веществ, а также подвижной фазы.

Приготовление испытуемых растворов. 0,01 г соединения (точная навеска) растворяли в подвижной фазе, используя мерную колбу вместимостью 50 мл. Переносили 5 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 25 мл, после чего объем раствора доводили до метки тем же растворителем.

Условия определения посторонних примесей в анализируемых образцах посредством ВЭЖХ анализа для 2-замещенных 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3H)-она

Хроматограф Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США), снабженный УФ-детектором UWD-3000. Хроматографическая колонка Luna C18(2) 150 х 4,6 мм (Phenomenex, США) с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,5 % муравьиной кислоты в объемном соотношении компонентов 65:35, продолжительность анализа 30 минут, температура колонки 30 °С, объем пробы 20 мкл, длина волны детектирования 210 нм. В случае 2j и 2k в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты в объемном соотношении компонентов 80:20. В указанных условиях проводили хроматографирование синтезированных и исходных веществ, а также подвижной фазы.

Приготовление испытуемых растворов. 0,01 г соединения (точная навеска) растворяли в ацетонитриле, используя мерную колбу вместимостью 100 мл. Переносили 5 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 10 мл, после чего объем раствора доводили до метки.

Рисунок 1. Синтез 2-замещенных 5,6,7,8-тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3 Н )-она (2a-2s) и их азометиновых предшественников (1a-1s)

3a; R = -C H, R = -CH -COOH

3b; R = -C H , R = -CH -C(O)-NH-CH -COOH

3e; R = -C H , R = -CH -COOH

3f; R = -C H , R = -CH -C(O)-NH-CH -COOH

3c; R1 = -C2H5, R2 =

3d; R1 = -C2H5, R2 =

3g; R1 = -C3H7, R2 =

3h; R = -C H, R =

3i; R = -CH(CH) , R = -CH -C(O)-NH-CH -COOH

3k; R = -CH ; R = -CH COOH

3l; R = Ph; R = -CHCOOH

3m; R = Ph; R = -CHCOOH

3j; R1 = -CH(CH3)2, R2 =

Рисунок 2. Синтез производных 6,7-диметоксикиназолин-4(3 Н )-она (3а-3m)

Условия определения посторонних примесей в анализируемых образцах посредством ВЭЖХ анализа для производных 6,7-диметоксихиназолин-4(3H)-она

Хроматограф Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США), снабженный УФ-детектором VD-3000. Хроматографическая колонка Luna C18(2) 150 х 4,6 мм (Phenomenex, США) с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза для 3a, 3b, 3e, 3f, 3i и 3k: смесь ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты в объемном соотношении компонентов 20:80. Подвижная фаза для 3c, 3d, 3g, 3h, 3j, 3l и 3m: смесь ацетонитрила и 0,5% муравьиной кислоты в объемном соотношении компонентов 35:65. Продолжительность анализа 30 минут, температура колонки 30 °С, объем пробы 20 мкл, длина волны детектирования 210 нм. В указанных условиях проводили хроматографирование синтезированных и исходных веществ, а также подвижной фазы.

Приготовление испытуемых растворов. 0,01 г соединения (точная навеска) растворяли в ацетонитриле, используя мерную колбу вместимостью 100 мл. Переносили 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 10 мл, после чего объем раствора доводили до метки подвижной фазой.

Результаты и обсуждение

ВЭЖХ-анализ с детектированием при неспецифичной длине волны 210 нм показал удовлетворительное разделение синтезированных соединений и посторонних примесей. В выбранных условиях определения соблюдались приемлемые характеристики хроматографических пиков всех целевых соединений – эффективность – от 5000 до 7900 теоретических тарелок, фактор асимметрии для соединений не превышает 1,5.

Предварительное изучение УФ-светопоглощения растворов синтезированных соединений и исходных веществ в подвижной фазе при 210 нм позволило заключить, что фактор отклика детектора в отношении потенциальных примесных соединений не выходит за границы диапазона 0,8-1,2. Это, в свою очередь, позволило использовать метод внутренней нормализации для оценки содержания целевых веществ и посторонних примесей в синтезированных субстанциях [20]. При расчете не учитывали площади пиков, полученных при хроматографировании подвижной фазы. Результаты оценки чистоты синтезированных субстанций представлены в Таблице 1.

Таблица 1

РЕЗУЛЬТАТЫ ОЦЕНКИ ЧИСТОТЫ АНАЛИЗИРУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Соединение	Содержание целевого компонента, %	Относительное время удерживания пика соединения, мин
1a	99,6	6,79
1b	98,0	2,06
1c	97,5	3,00
1d	99,1	3,52
1e	97,1	3,62
1f	96,2	3,01
1g	96,2	1,82
1h	99,5	9,09
1i	98,8	6,93
1j	98,7	6,06
1k	99,5	10,57
1p	97,6	4,66
1q	98,8	6,02
1r	97,3	4,48

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №12. 2022

2a	97,6	5,36
2b	95,7	6,31
2c	95,5	2,32
2d	99,6	2,58
2e	97,3	2,39
2f	98,9	5,09
2g	99,5	2,86
2h	96,6	7,59
2i	99,4	5,58
2j	99,7	7,42
2k	99,1	9,18
2p	98,7	2,92
2q	98,2	4,01
2r	95,4	6,00
3a	98,9	6,03
3b	99,4	3,59
3c	95,4	3,96
3d	96,0	4,89
3e	98,7	11,79
3f	99,0	6,18
3g	98,9	6,06
3h	97,9	9,17
3i	97,8	9,83
3j	96,3	8,77
3k	95,6	5,87
3l	98,9	3,93
3m	99,1	3,92

Примечание – растворимость соединений 1l-1o, 1s и 2l-2o, 2s в метаноле, ацетонитриле, воде и разбавленных кислотах была неудовлетворительна для проведения ВЭЖХ-анализа в обращенно-фазовом варианте

Как следует из представленных результатов, анализируемые соединения обладают высокой чистотой, что важно для проведения первичного фармакологического скрининга и создания лабораторного регламента получение активной фармацевтической субстанции. На Рисунке в качестве примера приведены хроматограммы соединений 1i.

Рисунок. ВЭЖХ хроматограмма 1i.

Заключение

Разработаны условия ВЭЖХ-анализа азометиновых производных 2-амино-4,5,6,7-тетрагидро-1-бензотиофен-3-карбоксамида,             2-замещенных             5,6,7,8- тетрагидробензо[4,5]тиено[2,3-d]пиримидин-4(3H)-она      и      производных      6,7- диметоксихиназолин-4(3Н)-она, которые можно использовать в дальнейших сепарационных исследованиях методом ВЭЖХ близких по строению органических соединений.

Результаты анализа свидетельствуют о высокой чистоте синтезированных веществ, что важно для достоверного проведения первичного фармакологического скрининга и дальнейшей разработки лабораторного регламента получения активной фармацевтической субстанции на базе соединений-лидеров.

Финансирование: Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-315-90060.

Financing . The reported study was funded by RFBR, project number 20-315-90060.