Влияние абиотических факторов на формирование жирно-кислотного состава масла плодов облепихи (Hippophae rhamnoides L.)

Введение. Изучение дикорастущих форм облепихи, являющихся природным генофондом и основой для селекции, представляет большой интерес и определяется потребностями медицины в облепиховом масле, которое получают из плодовой мякоти. Поэтому целью селекционной работы является создание новых крупноплодных сортов облепихи с высоким содержанием масла и биологически активных веществ в околоплоднике.

Большой вклад в изучение дикорастущих форм облепихи из различных географических регионов произрастания внес И.П. Елисеев [1]. Он показал, что географическое положение, рельеф местности, разная экспозиция склонов и высота над уровнем моря создают разнообразные экологические условия, влияющие на изменчивость морфологических признаков облепихи, её зимостойкость и длительность периода вегетации. Основываясь на морфо-физиологических показателях облепихи И.П. Елисеев выделил несколько крупных экологических категорий, названных им «климатипы вида»: 1. Сибирский климатип (СБ) объединяет все популяции Забайкалья,

Саяно-Алтайского горного района и Казахстанского Алтая, сформировавшиеся в суровых условиях континентального климата Восточной Сибири и Алтая. 2; Среднеазиатский климатип (СА) характеризует популяции, сформировавшиеся в условиях жаркого климата на склонах гор южной экспозиции и в полупустынных зонах; 3. Кавказский клима-тип (КВ) объединяет популяции, сформировавшиеся под влиянием разнообразных экологических условий Северного Кавказа и Закавказья; 4. Прибалтийский климатип (БТ) включает популяции зоны влажного климата с теплым летом и умеренно мягкой, ветреной зимой.

Особенность плодов облепихи заключается в том, что они запасают масла не только в семенах, но и в плодовой мякоти. Функции масла семян известны и определяются их использованием на процессы дыхания и прорастания. Роль масел околоплодников неизвестна, определяется высокой пищевой ценностью некоторых из них (оливы, авокадо и других) или лечебным эффектом (облепиха, лимонник). Ценность масла плодовой мякоти облепихи до недавнего времени связывали с высоким содержанием жирорастворимых витаминов (А, Д, Е), каротиноидов и других биологически активных веществ [2; 3; 4; 5]. К настоящему времени накапливаются данные о положительном влиянии индивидуальных жирных кислот на здоровье человека [6]. Показано, что высокая концентрация пальмитиновой кислоты в масле (от 30 % и выше) оказывает регуляторное действие на обмен липидов и глюкозы, стимулирует действие инсулина в мышцах, снижает уровень триацилглицеринов в клетках печени [7]. Установлено, что олеиновая кислота снижает уровень холестерина, риск возникновения инсультов и инфарктов [8]. Принимая во внимание влияние индивидуальных жирных кислот на физиолого-биохимические процессы в организме человека, изучение жирно-кислотного состава масла плодов облепихи представляет несомненный интерес.

Ранее нами изучалась динамика содержания и жирно-кислотного состава липидов в созревающих плодах облепихи [9; 10]. Продолжая эти исследования, мы провели определение влияния климатических факторов на формирование качественных показателей масла.

Целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа жирно-кислотного состава масла гипантия и семян облепихи из разных эколого-климатических регионов

(климатипов) и изучение влияния условий произрастания облепихи на состав и содержание индивидуальных жирных кислот в масле.

Материалы и методы. Плоды дикорастущих форм облепихи собирали в ходе экспедиционных обследований в разных регионах произрастания: Средней Азии - Горный Бадахшан, бассейн реки Пянж (среднеазиатский климатип), Западном Закавказье - бассейн реки Чорохи (кавказский климатип), Прибалтике -Балтийская Коса, р-н пос. Донское (балтийский климатип) и Сибири - побережье реки Катунь (Сибирский климатип).

Навеску плодов облепихи (30 г) помещали в химический стакан, заливали хлороформом и выдерживали 1 мин для удаления восков с поверхности плодов. Хлороформ удаляли, плоды переносили в колбу с кипящим изопропанолом (изопропиловым спиртом) и кипятили с обратным холодильником 30 мин для инактивации ферментов, после чего колбу с растительным материалом охлаждали при комнатной температуре. Хранили пробы в этих же колбах с притертыми пробками в холодильнике при температуре от 0 до -2 оС.

Экстракцию липидов гипантия и семян проводили по отдельности. Для экстракции липидов из гипантия изопропанольную вытяжку из колбы с растительным материалом профильтровывали через стеклянный фильтр экстрактора [11], присоединенного к мерной колбе на 500 мл и водоструйному насосу, для создания разряжения воздуха в колбе. Плоды облепихи обмывали ацетоном 3 раза (3 х 20 мл), изопропанольную вытяжку и ацетоновые экстракты объединяли. Затем из плодов извлекали семена с помощью пинцета и глазного скальпеля. Выделенные семена также промывали 3 раза (3 х 20 мл) ацетоном и объединяли с ацетоновыми и изопропанольной вытяжками. Плодовую мякоть растирали в ступке с ацетоном до получения частиц ткани около 0,25 мм, каждый раз сливая ацетоновую вытяжку в экстрактор. Семена высушивали при комнатной температуре и удаляли семенные покровы. Очищенные семена растирали в фарфоровой ступке с ацетоном (3 х 20 мл) до получения частиц около 0,25 мм, каждый раз сливая липидную вытяжку в экстрактор, присоединенный к мерной колбе на 200 мл.

Экстракцию липидов из высушенных тканей плодовой мякоти и семян проводили по отдельности смесями хлороформа, метанола и воды (в соотношении 3 : 2 : 0,17) и хлороформа, метанола и концентрированной азотной кислоты (2 : 1 : 0,03) по методу Жукова и Верещагина [11].

Масло, являющееся триацилглицеринами, выделяли из экстракта суммарных липидов гипантия и семян по отдельности методом тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках с силикагелем. Стеклянные пластинки 20 × 20 × 0,2 устанавливали в автоматический аппликатор и наносили на них слой силикагеля ЛСЛ 254 , содержащий 13 % гипса, суспензированного в воде, толщиной 1,5 мм. Пластинки высушивали на воздухе в течение 15–18 ч, после чего их использовали для препаративного выделения триацилглицеринов, не содержащих сопутствующих веществ, главными из которых являются пигменты (хлорофиллы и каротиноиды, а также полярные липиды).

Экстракт липидов семян (5 мл) и гипантия (2 мл) упаривали на роторном испарителе досуха, остаток растворяли в 0,3 мл хлороформа и микрошприцом наносили на слой адсорбента на расстоянии 10–12 мм от нижнего края стеклянной пластинки, высушивали на воздухе и помещали в хроматографическую камеру. Подвижной фазой служила смесь гексана, диэтилового эфира и уксусной кислоты в соотношении 80 : 20 : 1 по объему. На пластинке выделялось три зоны: стартовая зона, вещества которой не передвигались с используемой подвижной фазой, триацилглице-рины, пигменты.

После достижения подвижной фазы верхнего края пластинки, ее доставали из хроматографической камеры, высушивали на воздухе, после чего края пластинки опрыскивали 0,01 %-ным водным раствором родамина 6Ж, после чего каждая из зон, обработанных родамином, хорошо просматривалась в ультрафиолетовом свете. Селикагель, содержащий триацилглицерины, счищали скальпелем и помещали в круглодонную колбу объемом на 50 мл. Триацилглицерины элюировали с адсорбента хлороформом 3 раза, элюат собирали в другую колбу на 50 мл, жидкую фазу отгоняли на роторном испарителе. К выпаренному осадку добавляли 20 мл этанола, 2 капли воды, 3 гранулы NaOH и проводили омыление при температуре кипения этанола (78 оС) с обратным холодильником в течение 1,5 ч. К жидкости после омыления добавляли 5 капель воды и выпаривали на роторном испарителе. В колбу с высушенным остатком добавляли 1 мл воды и экстрагировали жирные кислоты гексаном до тех пор, пока гексановая фаза не бесцвечивалась. В гексановой фазе растворялись неомыляемые липиды, которые удалялись с гексаном. К водной фазе добав- ляли 2–3 капли метилоранжа до бледно-розового цвета, 3 капли 20 % Н2SO4 и промывали гексаном 6 раз. Гексановую фазу, содержащую жирные кислоты, сливали в чистую круглодонную колбу и выпаривали на роторном испарителе. Для метилирования жирных кислот (получения метиловых эфиров жирных кислот) сухой остаток жирных кислот растворяли в 5–6 каплях метанола, добавляли 2–3 капли хлористого ацетила, колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили при температуре кипения метанола (64 оС) в течение 1 ч. После окончания процесса метилирования жирных кислот метанол отгоняли на роторном испарителе, добавляли 3–4 капли воды, 2 капли метилоранжа, чтобы хорошо видеть расслоение фаз. Метиловые эфиры экстрагировали из водной фазы гексаном, растворитель выпаривали, метиловые эфиры растворяли в 3 каплях бензола и использовали для газо-жидкостной хроматографии.

Идентификацию жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии их метиловых эфиров, а также с помощью сочетания газожидкостной хроматографии с мас-спектрометрией (LKB 2091, Швеция). Колонку для газожидкостной хроматографии заполняли Целитом-545, жидкой фазой служил полиэтиленгликоль-адипат (ПЭГА), который наносили на поверхность Целита-545 в два приема; соотношение между ПЭГА и Целитом по массе составляло 1 : 9. Колонку помещали в термостат аргонового хроматографа и выдерживали при 200 оС до прекращения дрейфа нулевой линии прибора. Разделение метиловых эфиров жирных кислот проводили при температуре колонки 190 ± 1 оС; газ-носитель – аргон, расход 60 мл/мин, давление газа-носителя 1 атм. Объем пробы 0,25–0,5 мкл.

В результате газожидкостной хроматографии получали значения относительного удерживаемого объема (V R ^отн) отдельных видов метиловых эфиров жирных кислот гипантия или семян облепихи. Относительное содержание индивидуальных жирных кислот устанавливали методом триангуляции пиков и выражали в % от суммы метиловых эфиров жирных кислот.

Данные обработаны статистически. Достоверность различия между средними арифметическими признаков (х) определяли по критерию Стьюдента с вероятностью Р > 95 %.

Результаты и обсуждение. Результаты определения жирно-кислотного состава масла гипантия облепихи из четырех регионов представлены в таблице 1. Можно видеть, что, независимо от места произрастания облепихи, масло плодовой мякоти каждого из них включает по шесть главных видов жирных кислот, различающихся содержанием от их суммы.

Таблица 1

Жирно-кислотный состав масла гипантия облепихи четырех климатипов

Вид ЖК	Содержание жирных кислот, % от суммы кислот
	СА	БТ	СБ	КВ	Обле пиха [12]	Авокадо [13]	Мас лина [14]
С16:0	34,1 ±	32,4 ±	32,7 ±	47,0 ±	32,1 ±	23,0	11,7 ±
	1,0	1,2	2,5	1,7	1,2		0,9
С16:1	54,4 ±	42,3 ±	54,8 ±	16,1 ±	46,0 ±	1,8	1,6 ±
	1,6	0,9	2,6	0,7	1,9		1,1
С18:0	0,7 ±	0,6 ±	0,7 ±	1,0 ±	2,1 ±	1,8	3,1 ±
	0,3	0,1	0.1	0,3	0,6		0,3
С18:1	10,8 ±	20,6 ±	4,3 ±	34,5 ±	7,5 ±	56,4	78,6 ±
	0,2	1,2	0,4	1,0	3,4		3,1
С18:2	0,0	3,4 ±	5,9 ±	1,2 ±	11,5 ±	8,9	4,4 ±
		0,8	0,8	0,5	0,6		0,5
С18:3	0,0	0,7 ±	1,6 ±	0,2 ±	0,9 ±	8,1	0,6 ±
		0,3	0,1	0,1	0,1		0,1
[S]	34,8	33,0	33,4	48,0	34,1	24,8	14,8
[U]	65,2	67,0	66,6	52,0	65,9	75,2	85,2

Примечание: [ S] - суммарное содержание насыщенных жирных кислот; [U] - суммарное содержание ненасыщенных жирных кислот. В таблице 1 представлены средние арифметические трёх аналитических определений ± доверительный интервал. В масле гипантия облепихи содержатся: > 0,1–0,2 % меристино-вой кислоты (С 14:0); < 0,1-0,15 % пентадекановой (С 15:0) и гексадекадиеновой (С 16:2) < 0,5-1,0 %. Масло маслины содержит минорные арахиновую (С 20:0) и гадалеиновую (С 20:1) < 0,3 %

Наибольшее количество приходится на жирные кислоты, содержащие 16 углеродных атомов: пальмитиновую (С16:0) и гекса-деценовую (С16:1), суммарное содержа-ние которых различно в маслах плодовой мякоти представителей изученных климатипов: у представителей кавказского их уровень составляет 63,1 %; балтийского - 74,8 %; сибирского и среднеазиатского - концентрации соизмеримы и достигают 87,5 и 88,5 % соответственно. Содержание стеариновой кислоты (С18:0) в масле гипантия всех климатипов не превышало 1 % и практически не имело различий. По уровню мононенасы-щенной олеиновой кислоты (С18:1), различия более значительны (табл. 1). Максимальное количество этой кислоты у представителей кавказских популяций облепихи (34,5 %), а наименьшее - у сибирских (4,3 %).

Полученные результаты позволили установить, что масло гипантия каждого из климати-пов различается по содержанию индивидуальных жирных кислот, что определяет степень их ненасыщенности. По этому признаку масло плодовой мякоти изученных климатипов можно разделить на две группы: к первой из них относятся среднеазиатский, балтийский и сибирский, а ко второй - КВ, для которого характерно более высокое содержание пальмитиновой кислоты и низкое, в сравнении с остальными, мононенасыщенной гексадеценовой (пальмитолеиновой).

Сравнивая результаты настоящей работы с литературными данными, можно видеть, что они соизмеримы. Состав индивидуальных видов жирных кислот в масле плодовых оболочек облепихи, маслины и авокадо не различается по жирно-кислотному составу, включает по шесть главных кислот, количество которых от их суммы различно. По уровню пальмитиновой и гексадеценовой кислот масло плодовой мякоти облепихи превосходило масло авокадо и маслины [13; 14], но уступало им по концентрации олеиновой кислоты и степени ненасыщенности масла. Содержание доминирующих пальмитиновой и пальмитолеиновых кислот в облепихе сорта Дар Катуни (сибирский климатип) из коллекции НИИ садоводства Сибири (табл. 1) составляет 63,1 %, что приближает его к балтийскому кли-матипу [10].

Результаты по изучению жирно-кислотного состава масла семян четырех климатипов приведены в таблице 2. Можно видеть, что состав кислот масла семян четырех климатипов включает по шесть индивидуальных видов, главными из которых являются С18-ненасы-щенные: олеиновая, линолевая и линоленовая, на долю которых приходится 86–89 %. По степени ненасыщенности масло семян достигает 88,1-90,3 % и превосходит по этому признаку гипантий.

Сравнивая результаты настоящей работы (табл. 2) с литературными данными по изучению жирно-кислотного состава и содержанию индивидуальных кислот как сортовой облепихи разного эколого-географического происхождения [12], так и дикорастущих форм [15; 16], можно видеть, что они не имеют значительных различий по числу и составу главных кислот. В каждом из них доминируют С18-кислоты, уровень которых соизмерим и составляет 83,1-90,4 %.

Таблица 2

Жирно-кислотный состав масла семян облепихи четырех климатипов

Вид ЖК	Содержание жирных кислот, %
	СА	БТ	СБ	КВ*	СБ[12]	СА[15]	КВ[16]
С16:0	8,6 ± 1,2	7,1 ± 0,1	7,1 ± 0,3	7,9 ± 0,5	6,8–7,7	10,6	11,6
С16:1	2,5 ± 1,0	1,1 ± 0,2	0,6 ± 0,1	1,2 ± 0,1	0,4-1,3	5,9	4,5
С18:0	2,8 ± 0,3	2,6 ± 0,4	2,7 ± 0,5	3,7 ± 0,1	2,8-3,4	1,6	5,3
С18:1	24,0 ± 1,3	21,1 ± 0,9	16,6 ± 1,6	16,3 ± 0,7	14,7-15,6	26,6	15,1
С18:2	36,2 ± 1,8	34,9 ± 1,8	39,5 ± 2,1	45,2 ± 2,8	40,1-38,3	34,1	42,4
С18:3	25,9 ± 2,0	33,2 ± 2,3	33,5 ± 1,9	25,7 ±	35,2-33,7	21,2	21,1
[S]	11,4	9,7	9,8	11,6	9,8-11,1	12,2	16,9
[U]	88,6	90,3	90,2	88,4	90,4-88,9	87,8	83,1

Примечание: корреляция между найденными и литературными данными по жирно-кислотному составу масла каждого из климатипов достоверна (Р > 99 %). В масле семян содержатся    мири стиновая (С14:0) < 0,1 % и пентадекановая (С15:0), < 0,2 %

Таким образом, полученные данные позволили установить, что внутрипопуляционных колебаний жирных кислот как по числу, так и содержанию в масле семян изученных клима-типов, в отличие от околоплодников, не обнаружено. Изученные масла являются высоконенасыщенными и не имеют различий по содержанию главных жирных кислот.

Выводы. 1. Масло гипантия и семян включает по шесть главных жирных кислот. 2. Масло плодовой мякоти и семян различается степенью ненасыщенности; в гипантии доминируют насыщенные кислоты, на долю которых приходится 34–48 % от их суммы, а в семенах – ненасыщенные, уровень которых достигает 88,4–90,3%, что и определяет качество масел в каждом из этих органов. 3. Абиотические факторы оказывают существенное влияние на жирно-кислотный состав масла плодовой мякоти и практически не влияют на состав кислот семян.