Влияние аэротехногенных загрязнений на состав сообществ эпифитных микромицетов г. Уфы

Биоиндикация урбанизированных экосистем традиционно находится в центре эколого-ботанических исследований. Индикаторами техногенного загрязнения служат как высшие, так и низшие растения. Работы, в которых исследовался грибной компонент техногенных экосистем, касаются, в основном, узкоспециализированных групп микоризообразователей [Станкявичене, Урбонас, 2006] или ксилотрофных грибов (как классические примеры растительно- грибного взаимодействия). Рекреация и загрязняющие вещества оказывают влияние на такие показатели, как видовое богатство, доминирование, деструктивная активность ксилотрофных грибов [Волчатова и др., 2007; Сафонов, Сафонова, 2009].

В то же время большой интерес представляет обширная и менее специализированная группа микроскопических грибов, не относящихся к кси-лотрофам, но обитающих на древесной коре и наряду с водорослями и цианобактериями образующих макроскопические разрастания. Ранее были

получены данные, что фикобионты не являются индикаторами воздушного загрязнения [Дубовик, Шарипова, 2016], однако данные о микобионтах отсутствуют. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• -    определить видовой состав микроскопических грибов коры древесных растений, их приуроченность к разным форофитам ;

• -    сравнить микобиоту контрольной и промышленной зон на территории г. Уфы;

• -    изучить особенности сезонной динамики видового состава комплекса микромицетов;

• -    провести сравнительные исследования влияния промышленного загрязнения на комплекс микромицетов коры древесных растений, выявить возможность их использования для биоиндикации, дать оценку экологически опасным последствиям

трансформации комплексов микроскопических грибов.

Материал и методы исследования

В качестве объектов для стационарного исследования были выбраны пять видов древесных растений: хвойные (ель сибирская – Рicea obovata Le-deb.) и лиственные (береза повислая – Betula pen-dula Roth, тополь черный – Populus nigra L., липа сердцелистная – Tilia cordata Mill., рябина обыкновенная – Sorbus aucuparia L.). Выбор этих фо-рофитов обусловлен их широким распространением на данных территориях. Исследования проводились в рекреационной (фоновой) зоне города (контроль) и промышленной (территория нефтеперерабатывающего комплекса «Башнефть», расположенного в северной части г. Уфы) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика соcтояния воздушного бассейна по основным загрязнителям в изученный период

Наименование примеси	Промышленная зона, мг/м3	Зона контроля, мг/м3	Значение ПДКс.с., мг/м3
Взвешенные вещества	0.15	0.06	0.15
Диоксид серы	0.005	0.002	0.05
Оксид углерода	2.0	1.4	3.0
Диоксид азота	0.04	0.02	0.04
Хлорид водорода	0.04	-	0.1
Формальдегид	0.006	-	0.003
Бензол	0.02	-	0.1
Четырёххлористый углерод	0.01	-	0.7
Хлороформ	0.012	-	0.03
Бенз(а)пирен	2.8	-	1.0

Образцы коры деревьев (всего 316) отбирали на высоте 150–155 см от поверхности почвы. Каждый образец являлся средней пробой, полученной при смешивании 10 индивидуальных с одного вида древесных растений в разные сезоны. Образцы коры размером приблизительно 5 x 5 см и толщиной 2–5 мм. При сборе проб и подготовке их к анализу соблюдали необходимые условия стерильности.

Выделение и количественный учет микромице-тов проводили по общепринятой методике посева суспензии измельчённой коры на агаризованную подкисленную среду Чапека ( в трех повторностях). Состав среды: сахароза – 30.0 г; NaNO 3 – 2.0; K 2 HPO 4 – 1.0; MgSO 4* 7H 2 O – 0.5; KCl – 0.5; FeSO 4* 7H 2 O – 0.1; агар – 20.0г; вода дистиллированная – 1000 мл. Для роста грибов среду подкисляли (0.5% молочной кислоты). Инкубирование проводили при температуре 27–28^оС. Учет микро-мицетов осуществляли на седьмые сутки [Методы …, 1991]. Для определения патогенности выделенных нами видов, использовали классификацию С. Де Хога [Марфенина, 2005].

Идентификацию видов микромицетов проводили по определителям [Милько, 1974; Билай, Коваль, 1988; Билай, Курбацкая, 1990; de Hoog et al., 2000; Саттон, Фотергилл, Ринальди, 2001]. Видо- вые названия грибов уточняли по пополняемым спискам опубликованных видов в базе данных «Index fungorum» (.

Учет мицелия грибов проводили методом мембранных фильтров в модификации Демкиной и Мирчинк. Использовали фильтры марки «Сын-пор» с диаметром пор 2.5 мкм или диаметром 35 с порами 2.5 мкм и краситель дианиловый голубой. Суммарную длину гиф мицелия в 1 г почвы рассчитывали по формуле b x104 5и102 a =-----------s-,

50 PVC 10⁸

где а – длина гиф в 1 г почвы (см); b – суммарная длина гиф на фильтре в 50 полях зрения в единицах окуляр-микрометра (мкм); S – площадь фильтра (мм²); n – разведение почвенной суспензии; P – площадь зрения (мкм²); V – объем наносимой суспензии; С – навеска почвы, коры (г).

Для установления типичных и доминантных видов определяли обилие (плотность) вида – отношение числа штаммов данного вида к общему числу всех видов. Доминантность вида определяется по его обилию (абсолютные доминанты – свыше 50% от всех имеющихся форм; доминанты первого ранга от 25 до 50%; доминанты второго ранга от 5 до 25% от всех имеющихся форм) [Мирчинк, 1988].

Для определения значимости вида применяли критерий частоты встречаемости по показателю временной частоты встречаемости вида, устанавливаемый как отношение числа моментов времени, когда вид обнаружен, к общему числу моментов отбора образцов.

При совместном использовании показателей пространственной и временной частот встречаемости Т.Г. Мирчинк [1988] предложено характеризовать структуру почвенных микромицетов следующим образом: типичные доминирующие виды – пространственная и временная частота встречаемости выше 60%; типичные частые – пространственная и временная частота встречаемости более 30%; типичные редкие – пространственная частота встречаемости ниже 30% и временная выше 30% и случайные виды – оба показателя ниже 30%. При анализе особенностей микобиоты использовался коэффициент сходства Сё-ренсена [Одум, 1986].

Статистическую обработку результатов производили с применением пакета прикладных программ Statistica V 6.0.

Результаты и их обсуждение

Был выявлен 41 видовой таксон эпифитных микромицетов, которые в зоне нефтехимического комплекса были представлены 23 видами, а в контрольной зоне города – 28. Доминирующее положение по числу видов на коре деревьев занимают представители рода Penicillium, что составляет 61% от всех выделенных видов. В промышленной зоне этот род представлен 10 видами, а в зоне контроля – 18. В фоновой зоне большая встречаемость представителей рода Mucor, составляющая 67% от общего числа эпифитных микромицетов. Представителей данного рода в промзоне обнаружено не было. Г.А.Евдокимовой, М.В. Корнейковой, Е.В. Лебедевой [2007] также была отмечена чувствительность представителей порядка Mucorales к выбросам алюминиевого предприятия. Было показано, что сопутствующая микромицетам альгофлора не зависит от аэротехногенного загрязнения [Дубовик, Климина, 2010; Дубовик, Киреева, Климина, 2012; Дубовик, Шарипова, 2016].

В наших исследованиях выявлен рост доли грибов родов Aspergillus и Trichoderma относительно микромицетов рода Penicillium и появление меланинсодержащих грибов в зоне возле промышленных предприятий. Подобные изменения наблюдали в комплексах микромицетов городских почв [Марфенина, 1999] что, возможно, указывает на единый механизм воздействия антропогенных факторов на микроскопические грибы почвенного и надпочвенного ярусов городской экосистемы. О.Е. Марфенина [1989] отмечала интенсивное развитие грибов данного рода при высоком уровне загрязнения тяжёлыми металлами. Кроме того, в зоне промышленного загрязнения отмечена большая частота встречаемости ряда видов микромицетов из рода Aspergillus .

Анализ частых, редких и случайных видов также показал качественные различия. На территории нефтеперерабатывающего предприятия доминантные формы грибов практически сохраняются, но происходит обеднение видовой структуры комплексов микромицетов за счёт выпадения числа редких видов (табл. 2).

Таблица 2

Частота встречаемости микроскопических грибов на коре древесных растений в промышленной (П) и контрольной (К) зонах

№	Таксон	П	К	Уровень патогенности
Класс Zygomycetes
1	Mucor sp.	-	Д
2	Rhizopus microsporus Tiegh.	С	-
Класс Hyphomycetes
3	*** Alternaria alternata (Fr.) Keissl.	Д	ТЧ	BSL-2
4	*** Aspergillus candidus Link	С	-
5	*** A. flavusvar.orysae (Ahlb.) Kurtz.	ТЧ	-
6	*** A. fumigates Fresen.	Д	Д	BSL-2
7	A. fumigatus var. griseibrunneus Rai et Singh	ТЧ	-	BSL-2
8	*** A. nigervar.niger Tiegh.	Д	Д	BSL-2
9	A. sulphureus Desm.	-	С
10	** A. terreus Thom	С	-	BSL-2
11	*** Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud	ТР	-	BSL-2
12	Isaria farinosa (Holmsk.) Fr.	-	С
13	Penicillium albocinerascens Chalab.	ТЧ	С

Окончание табл. 2
№	Таксон	П	К	Уровень патогенности
14	P. aculeatum Raper&Fennell	-	С
15	P. atrovenetum G. Sm.	-	C
16	* P. canescens Sopp	ТЧ	-
17	*** P. chrysogenum Thom	С	-	BSL-1
18	*** P. citrinum Sopp	С	Д	BSL-2
19	P. corylophiloides S.Abe	-	С
20	P. cyaneum (Bainier&Sartory) Biourge ex Thom	-	С
21	P. duclauxii Delacr .	-	ТЧ
22	* P. funiculosum Thom	-	ТЧ	BSL-2
23	*** P. glabrum (Wehmer) Westling	С	-
24	P. implicatum Biourge	-	С
25	* P. lanosum Westling	ТЧ	Д
26	P. melinii Thom	-	С
27	P. nalgiovense Laxa	-	ТР
28	P. ochraceum Corda	ТР	-
29	P. purpurescens (Sopp) Biourge	-	C	BSL-2
30	*** P. purpurogenum Fleroff	-	ТЧ
31	P. resticulosum Birk., Raistrick& G. Sm.	-	ТР
32	* P. simplicissimum (Oudem.) Thom	С	-
33	P. solitum var. crustosum (Thom) Bridge	ТЧ	-
34	P. solitum var. solitum Westling.	-	C
35	* P. velutinum J.F.H. Beyma	-	ТЧ	6
36	* P. variabile G. Mey.	С	Д	BSL-2
37	Trichoderma citrinoviride Bissett	-	ТР
38	** T. harzianum Rifai	ТЧ	ТР
39	*** T. koningii Oudem.	С	С	BSL-1
40	** T. viride Pers.	Д	ТЧ	BSL-2
Класс Coelomycetes
41          \	** Phoma glomerata (Corda) Wollenw. & Hochapfel	С	-
ВСЕГО		23	28

Примечание: Д – доминантные; ТЧ – типичные частые; ТР – типичные редкие; С –случайные; * – фитотоксич-ный вид; ** – оппортунистический вид; *** – условно патогенные.

Только для загрязнённой территории характерны Rhizopus microsporus, Aspergillus candidus, A. fumigates var. griseibrunneus, A. terreus, Aureo-basidium pullulans, Penicillium canescens, P. ochraceum, P. chrysogenum, P. simplicissimum, P. solitumvar. crustosum, P. glabrum, Phoma glomerata. Микромицетами, обнаруженными только в контрольной зоне, были: Mucor sp., Aspergillus sulphureus, Isaria farinosa, Penicillium aculea-tum, P. purpurescens, P. duclauxii, P. corylo-philoides, P. cyaneum, P. melinii, P. funiculosum, P. implicatum, P. nalgiovense, P. purpurogenum, P. ve-lutinum, P. resticulosum, P. solitum var. solitum, Trichoderma citrinoviride.

Сравнение частоты встречаемости сходных видов в сообществах эпифитных микромицетов загрязнённой и контрольной зон показало неоднозначный результат. Так, на двух сравниваемых участках виды Aspergillus fumigatus, A. niger var. niger являются доминирующими, они встречались практически во всех образцах коры древесных растений. Penicillium albocinerascens, входивший в группу случайных видов на незагрязненной территории, становился частым при загрязнении. Напротив, виды Penicillium citrinum, P. variabile оказались чувствительными к аэротехногенному загрязнению. При сравнении комплексов микроми-цетов промышленной и контрольной зон коэффициент Сёренсена составил 38%.

На коре древесных растений промышленной зоны численность микроскопических грибов была несколько выше, чем в контрольной (рис. 1). Так как развитие колоний грибов происходит преимущественно из спор, то увеличение количества мик-ромицетов, возможно, связано с усилением споруляции при аэротехногенном загрязнении. Очевидно, спорообразование способствует выживанию микробиоты в неблагоприятных условиях.

Измерение длины мицелия показало колебание данной величины в пределах от 0.26 до 1.64 м/г и зависимость как от места отбора пробы, так и от вида форофита, кора которого была использована для микологического анализа (рис. 2). Промышленное загрязнение нефтеперерабатывающего комплекса оказывало влияние на длину гифов, приводя к увеличению их длины в 2–5 раз. Тенденция к увеличению количества мицелия на стволах деревьев четко прослеживалась для таких пород, как береза (в 4.9 раз), тополь (в 3.8 раз). Поскольку длина мицелия является степенью активности грибов [Домр показали, что в промыщленной зоне складываются благоприятные условия для развития эпифитных микромицетов на коре всех исследованных форо-фитов. В то же время на коре ели длина грибных гиф в промышленной и контрольной зонах ниже, чем на листопадных деревьях. Возможно, наблюдаемые различия связаны с наличием в коре хвойных пород биологически активных веществ, способных влиять на рост и размножение микроорганизмов [Смирнов и др., 2002].

Рис. 1 . Численность микроскопических грибов на коре древесных растений, КОЕ х 10 3 /г

Рис. 2 . Средняя длина гиф (м/г) микромицетов, выделенных с коры деревьев, произрастающих в промышленной и контрольной зонах

Анализ видового состава микроскопических грибов показал наличие на коре деревьев оппортунистических и фитопатогенных видов. Были обнаружены условно патогенные виды грибов, относящиеся к родам Alternariа, Aspergillus, Aureo-basidium, Penicillium, Trichoderma, Phoma. Представители этих родов являются возбудителями заболеваний органов дыхания, кожных покровов, а также способствуют развитию аллергических реакций. На территории промзоны, по сравнению с контрольной, выявлено больше условно патогенных микромицетов, доля которых в контрольной зоне составляла 29%, а в зоне промышленного загрязнения – 57% от общего числа видов (рис. 3). Оппортунистические микозы человека, вызываемые условно патогенными грибами, представляют собой обширные поражения грибным мицелием слизистых оболочек или легких (реже других внутренних органов) у пациентов, страдающих иммунодефицитными состояниями или в послеоперационный период [Марфенина, 2005]. Отмечены изменения в структуре комплексов условно патогенных видов грибов на коре деревьев в фоновой и загрязнённой зонах, а именно: только в составе комплекса грибов загрязнённой зоны выявлены условно патогенные виды: Aspergillus candidus, A. flavus var.orysae, A. terreus, Aureo-basidium pullulans, Penicillium chrysogenum, P. gla-brum, Phoma glomerata.

оппортунистические фитопатогенные промы шленная зона контрольная зона

Рис. 3 . Соотношение фитопатогенных и оппортунистических видов микромицетов на коре древесных растений

Наибольшим обилием в исследуемых зонах среди других аэрофильных оппортунистических видов мик-ромицетов отличились Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, A. niger . Данная группа микромицетов представлена эврибионтными видами, выделяемыми из различных местообитаний; они часто обнаруживались в деградированных и химически загрязненных почвах [Терехова, 2007]. Также О.Е. Марфенина, Г.М. Фомичёва [2007] указывали на эвритопность таких потенциально патогенных микромицетов, как Al-ternaria alternata, Aspergillus niger . Все три вида могут выступать в качестве аллергенов; кроме того, Aspergillus fumigatus может вызывать микозы у больных с ослабленной иммунной системой, а Alternaria alternata – известный фитопатоген согласно литературным данным [Соболев, 1999; de Hoog et al., 2000; Саттон, Фотергилл, Ринальди, 2001; Зачиняева, Лебедева, 2003].

Многие из выделенных нами видов грибов по опасности их для человека или по уровню патогенности относятся к 2 группам: BSL-1 и BSL-2 (см. табл. 2).

Грибы группы BSL-1 – это, в принципе, безопасные для здоровья людей. Но при нарушении кожных покровов они могут попадать в организм человека и вызывать локализованные микозы на фоне иммунодефицита. Грибы группы BSL-2 могут попадать в организм здорового человека и сохра- няться в нём, вызывая локализованные микозы. В ослабленном организме они могут распространяться более широко и проявлять свойства оппортунистов. В промышленной зоне их доля от видового разнообразия составляет 56%, тогда как в контроле – только 32%.

Аналогичным образом реагировали на загрязнение и фитопатогенные микромицеты. Как неблагоприятное воздействие загрязнения на экосистему можно расценивать и появление дереворазрушающего гриба Phoma glomerata на коре рябин промышленной зоны. А.Б. Кулько и О.Е. Марфениной [2001] также отмечено увеличение частоты встречаемости данного тёмноокрашенного пикнидиаль-ного гриба в снеговом покрове придорожной зоны.

Распространение потенциально патогенных микромицетов имеет определённую сезонную динамику. Наибольшее число оппортунистических микромицетов было обнаружено в летний и осенний периоды, 9 и 11 видов соответственно, а наименьшее (6 видов) в зимний период (табл. 3). По-видимому, низкие температуры воздуха оказываются лимитирующими для развития микробиоты. Схожие данные получены О.Е. Марфениной [2002], которая отмечает, что летний и осенний периоды являются самыми благоприятными временами года для развития опасных плесеней.

Обилие условно патогенных микромицетов

Таблица 3 коры древесных растений в разные сезоны

Виды микромицетов	Время года
	Весна		Лето		Осень		Зима
	П	К	П	К	П	К	П	К
Alternaria alternata	0.75	-	1.44	1.93	2.71	1.9	1.52	-
Aspergillus candidus	-	-	-	-	1.2	-	-	-
A. fumigatus	2.15	1.95	3.6	0.6	3.35	1.7	2.33	0.85
A. nigervar.niger	9.4	8.3	8.52	6.96	3.35	1.6	2.0	1.2
A. flavus var. oryzae	-	-	1.6	-	1.16	-	-	-
A. terreus	-	-	0.12	-	-	-	-	-
Aureobasidium pullulans	0.43	-	-	-	-	-	-	-
Penicillium chrysogenum	-	-	-	-	1.6	-	-	-
P. citrinum	-	0.3	0.18	0.8	-	0.3	0.12	0.12
P. glabrum	-	-	-	-	0.5	-	-	-
P. purpurogenum	-	0.75	-	-	-	-	-	0.6
Trichoderma viride	0.24	-	0.7	0.96	0.57	0.12	0.5	-
T. koningii	1.6	-	2.33	-	1.16	0.75	-	-
T. harzianum	-	-	-	-	2.0	0.24	-	-
Phoma glomerata	-	-	0.12	-	-	-	-	-
Всего	6	4	9	5	10	7	5	4
Всего видов	8		9		11		6

Заключение

Таким образом, проведенные исследования образцов коры древесных растений позволили выявить 41 вид микроскопических грибов. Изучен- ные древесные растения по степени уменьшения видового разнообразия можно расположить в следующем порядке: Betula pendula Roth. – 23 вида → Populus nigra L. – 21 → Tilia cordata Mill. – 16 → Рicea obovata Ledeb. – 9→ Sorbus aucuparia L. – 6.

В зоне промышленного загрязнения наблюдалось упрощение видовой структуры комплекса микромицетов, при этом отмечено увеличение длины гиф и биомассы грибного мицелия на стволах древесных растений вблизи нефтеперерабатывающего комплекса. Также на загрязнённой территории обнаруживалось большее число условно патогенных для человека и животных видов микро-мицетов, чем на контрольной территории. Аналогичным образом реагировали на загрязнение и фи-топатогенные микромицеты, в промышленной зоне их количество возрастало по сравнению с таковыми фоновой территории.

Полученные результаты могут быть использованы для биоиндикации. Нами показано, что промышленное загрязнение нефтехимического комплекса приводит к изменениям в комплексах микроскопических грибов, обитающих на коре древесных растений. Это может способствовать накоплению грибного мицелия на коре с перераспределением доминирования к небольшому числу устойчивых видов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека.