Влияние акустического воздействия ультразвука на биосинтез экзополисахаридов и реологические свойства кисломолочных продуктов, полученных на основе кефирного грибка

В настоящее время исследования в области питания направлены не только на разработку норм количественного потребления продуктов питания, но и на обоснование качественных аспектов, основу которых составляют принципы сбалансированности питания. Мировое научное сообщество рассматривает кисломолочные продукты в качестве основы здорового питания человека, способствующей сохранению здоровья, предупреждению ряда заболеваний и увеличению продолжительно- сти жизни [1, 3, 15]. Наряду с благоприятным влиянием на нормальную микрофлору кишечника, кисломолочные продукты, в том числе кефир и кефирные напитки, выполняют функции обеспечения организма необходимыми эссенциальными и биологически активными веществами.

Сообществом ученых доказано, что потребление кефира благоприятствует усвоению белка, стимулирует иммунную систему, улучшает пищеварение. Кефир обладает противовоспалительным и противоаллергическим действием [8, 12], низким гликемическим индексом, что определяет терапевтический потенциал в лечении аллергической бронхиальной астмы и диабета, обладает противобакте-риальным, противоопухолевым действием.

Кефир является сложным продуктом, содержащим кроме продуктов молочнокислого и спиртового брожения живые клетки молочнокислых бактерий, дрожжи и продукты их метаболизма. Известно, что кефирные грибки являются уникальной симбиотической системой, которая представляет собой эволюционно сложившуюся ассоциативную культуру. Действительно, микроорганизмы в сообществах более устойчивы к различным воздействиям: изменениям рН, температуры, лимитированию субстратами и др. В таких сообществах между видами конкуренция обнаруживается редко. Даже когда один из видов благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, другие сохраняют жизнеспособность [2, 10, 13, 17].

Микроорганизмы кефирных грибков проявляют антагонизм по отношению к C. albicans, к мицелиальным грибам родов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Mucor, Absidia, Rhizopus, Cunnunghamella, причем ингибирующее действие на рост грибов оказывают не только микроорганизмы кефира, но и их метаболиты, образуемые в процессе культивирования. Современные исследования объясняют механизмы взаимодействия между бактериями в кефирных грибках. Две гетерофер-ментативные бактерии L. kefir и L. parakefir обладают поверхностным белковым слоем (Slayer), чем и объясняется их способность к са-моагрегации и агглютинации. Эти бактерии способны удерживаться на клетках Сасо-2 (аденокарциномы толстого кишечника человека), тем самым показывая хорошие пробиотические свойства данных бактерий [8, 9, 16].

Несмотря на то, что сегодня в нашей стране среди населения все больше доминирует тенденция здорового образа жизни, тем не менее, объем потребления кефира и кефирных продуктов на душу населения составляет всего 7,4 кг в год. Хотя в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 2 августа 2010 г. № 593н рациональный объем потребления кефира и кефирных продуктов на одного человека в год должен составлять порядка 36 кг в год [4].

Практически все молокоперерабатывающие предприятия осуществляют выработку кефира и кефирной продукции. В 2014 году, по сравнению с 2013-м, объем производства кефира и кефирной продукции в РФ сократился на 1,2 % в натуральном выражении, или на 12,714 тысячи тонн. Эффективному развитию российского рынка кефира и кефирных продуктов в значительной степени препятствует сезонность производства, обусловленная динамикой сырьевого рынка.

Сегодня производство кефирной продукции и кефира в основном выстроено на использовании лиофилизированных заквасок прямого внесения, так как технология производства собственных кефирных заквасок весьма кропотлива и требовательна к условиям.

Патентный поиск в области разработок, связанных с кисломолочными продуктами, показал, что около 30 % разработок приходится на кисломолочные продукты с пробиотиками, 8 % – с пребиотиками, около 20 % – разработки, связанные с использованием вторичных продуктов переработки молочного сырья, более 10 % – с биологически активными веществами и такое же количество со стабилизирующими консистенцию системами.

Так, известен способ производства кефирного напитка (патент РФ 2409962) на основе внесения кедрового жмыха в количестве 0,5 %, а также внесение сиропа лактулозы в количестве 1,0 %. Изобретение позволяет получить напиток, обладающий высокими органолептическими показателями, бифидоген-ными свойствами, повышенной пищевой и биологической ценностью и хранимоспособ-ностью.

Способ ускоренного производства кефира (Патент РФ № 2010116681/10) включает сквашивание пастеризованного охлажденного молока с омагниченной напряженностью суспензией из молока и кефирной закваски.

При производстве кефира для детского и диетического питания (Патент РФ 2105485) предлагается проводить деаэрацию молока до внесения кефирной закваски и биомассы бифидобактерий.

Особый интерес представляют разработки в области исследования способов, благоприятствующих накоплению полисахаридов, продуцированных молочнокислыми микроорганизмами. Одним их таких ценных полисахаридов молочнокислых бактерий является экзополисахарид (ЭПС) кефиран, продуци- руемый кефирными грибками, который служит матрицей для удерживания, иммобилизации клеток микробных компонентов кефирных грибков. Кефиран производится некоторыми молочнокислыми бактериями, состоит из остатков глюкозы и галактозы (рис. 1) примерно в равном соотношении (1:1). Причем это соотношение может варьироваться в зависимости от условий культивирования и географического происхождения кефирных грибков. Известно, что кефиран влияет на реологические свойства кисломолочного продукта, выполняет функции стабилизатора, эмульгатора и влагоудерживающей системы [5, 16, 18, 19].

Кефиран обладает иммуномодулирующим, противоопухолевым, противовоспалительным, противоастматическим, ранозаживляющим действием. Он способствует снижению кровяного давления и уровня холестерина в крови за счет связывания гепатоэнте-рально циркулирующего холестерина в кишечнике. Обладает ингибирующим действием в отношении патогенных микроорганизмов рода Salmonella, Helicobacter, Shigella, Staphylococcus, и Escherichiacoli [18, 19].

Доказано, что ЭПС выступают в качестве механизма адаптации заквасочных микроорганизмов в среде молока, причем в зависимости от конкретных условий синтезируются экзополисахариды различного состава и свойств [6]. Экстракция данного минорного БАВ в промышленных масштабах и последующее его применение в технологии молочных продуктов представляется весьма сложной и дорогостоящей, поэтому интерес представляют более простые в техническом отношении методы [6, 10]. В связи с чем одним из перспективных подходов к решению различ- ных технологических задач в пищевой отрасли является ультразвуковое кавитационное воздействие на гетерогенные пищевые среды с жидкой фазой. Применение ультразвуковых кавитационных технологий, по сравнению с известными физическими способами, имеет ряд существенных преимуществ, обусловленных совокупностью специфических эффектов, которые оказывают комплексное действие, направленное на интенсификацию технологического процесса формирования потребительских свойств. Особенности протекания акустических ультразвуковых процессов в различных средах и их результаты активно изучаются О.Н. Красулей, С.Д. Шестаковым, Н.В. Дежкуновым, А.Г. Галстяном, M. Ashokkumar, D. Knorr, K.S. Suslick и другими авторами [7, 11, 14]. Коллективом ученых под руководством Н.А. Тихомировой, ведутся разработки в области модифицирования свойств цельного молока, используемого для производства кисломолочной продукции и творога. В частности, установлено, что совместная кавитация цельного молока с некоторым количеством сухого способствует изменению его дисперсности и углеводного состава, гомогенизирует и стабилизирует структуру.

Цель исследования – установление влияния акустических эффектов ультразвуковой кавитации на накопление экзополисахарида кефирана и реологические свойства сгустков кисломолочных напитков, ферментированных на основе кефирного грибка.

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали модельные образцы кисломолочных напитков, подготовленные в лабораторных условиях по традиционной (ТТИ ГОСТ Р 52093-005 «Кефир») и модифицированной с

Рис. 1. Химическая структура кефирана

применением УЗВ технологий:

• -    кефир, полученный с применением закваски кефирного грибка (ККГ);

• -    кисломолочный напиток на основе закваски прямого внесения - LAT LC К, состоящая из Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp.cremoris, Lactobacillus kefir, Acetobacter subsp. aceti, Saccharomyces lactis в иммобилизованном виде (ККЗ);

• -    кисломолочный напиток на основе комбинированной закваски (ККГ+КЗ).

В качестве акустического источника упругих колебаний использовался аппарат ультразвуковой технологический «Волна» модель УЗТА-О,4/22-ОМ (частота механических колебаний 22 ± 1,65 кГц).

Каждому из объектов исследования были определены условия ультразвукового воздействия с учетом вариаций по мощности (120 Вт – 30 % от паспортной, 180 Вт – 45 % от паспортной, 240 Вт – 60 % от паспортной) (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика условных кодов модельных образцов

Мощность обработки, Вт (% от номинальной мощности прибора)	Время обработки, мин
	1	3	5
120 (30 %)	1-30*	3-30	5-30
180 (45 %)	1-45	3-45	5-45
240 (60 %)	1-60	3-60	5-60

* «1-30» означает 1 минуту обработки про 30 % мощности прибора от паспортной.

В исследованиях использовались как стандартные, так и современные физикохимические, биохимические и микробиологические методы исследований.

Морфологию микрофлоры закваски изучали путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим и по Грамму, с последующим микрокопированием в иммерсионной системе с объективом с нанесением каплей кедрового масла.

Титруемую кислотность молочного сырья и продуктов переработки определяли титрометрическим методом с применением индикатора фенолфталеина (ГОСТ 3624), активную кислотность определяли потенциометрически с помощью рН-метров: рН-150, WTW pH/Cond 340І и стеклянного электрода ЭСЛ-

15-11 в паре с хлорсеребряным ЭВЛ-1М4 (по ГОСТ 26781).

Динамическую вязкость оценивали посредством определения предельного напряжения сдвига, на вискозиметре ротационном Brookfield DV-III Ultra. Диапазон вязкости определяли от 1 мПа·c до 6×106 мПа·c, диапазон скоростей – 0,01…250 об/мин. Определение степени синерезиса кисломолочных напитков осуществляется путем измерения количества сыворотки, выделившейся за 1 час свободного фильтрования 100 см3 продукта.

Количественное определение полисахарида (кефирана), производимого молочнокислыми бактериями, определяли по методу, предложенному Р. Еникеевым [6].

Результаты и их обсуждение

Изучение влияния акустических эффектов ультразвука проводили в несколько этапов. Производственную закваску на кефирном грибке вносили в количестве 5 % от массы заквашиваемой смеси. Культивирование осуществляли при температуре (23 ± 1) °С в течение 10…12 часов. Последующее созревание продукта проводили в течение 10…12 часов в условиях бытового холодильника (t = 4... 10 ° C). Комбинированную закваску, состоящую из закваски прямого внесения (сухой заквасочной культуры LAT LC K) в сочетании с закваской на кефирном грибке.

Комплексная оценка сгустков проводилась по следующим параметрам:

• 1)    динамика процесса сквашивания – по показателю «титруемая кислотность» и показателю «активная кислотность» (pH);

• 2)    оценка структурного состояния сгустков – по органолептическим показателям (консистенция и внешний вид); показателю «эффективная вязкость» и синеретическим свойствам сгустков (синерезис);

• 3)    функциональные свойства – по массовой доле кефирана; составу микрофлоры (качественный и количественный состав);

Исследования титруемой и активной кислотности осуществляли через каждый час в течение всего периода сквашивания.

Процессы сквашивания протекали идентично (табл. 2), наблюдалось некоторое снижение интенсивности кислотообразования в первые два часа для образцов, полученных на основе УЗВ, а затем – активизация процесса накопления молочной кислоты.

Исследования показали, что сквашивание кефиров на закваске кефирного грибка (обра-

Таблица 2

Результаты оценки титруемой кислотности в процессе сквашивания

Наименование	Титруемая кислотность, град. Т при культивировании в течение времени, ч
Режим УЗВ
	2	4	6	8	10
Контроль ККГ	34 ± 0,02	48 ± 0,03	68 ± 0,02	80 ± 0,05	103 ± 0,02
ККГ5-30	30 ± 0,04	43 ± 0,02	74 ± 0,04	84 ± 0,03	96 ± 0,05
ККГ 3-45	32 ± 0,03	46 ± 0,02	83 ± 0,02	92 ± 0,04	101 ± 0,04
ККГ 3-60	29 ± 0,03	43 ± 0,02	85 ± 0,03	94 ± 0,02	111 ± 0,03
Контроль ККГ+КЗ	27 ± 0,04	42 ± 0,02	68 ± 0,03	82 ± 0,03	104 ± 0,02
ККГ+КЗ 5-30	29 ± 0,04	45 ± 0,03	67 ± 0,05	83 ± 0,03	98 ± 0,05
ККГ+КЗ 3-45	32 ± 0,05	48 ± 0,04	73 ± 0,03	88 ± 0,02	106 ± 0,03
ККГ+КЗ 3-60	26 ± 0,04	45 ± 0,03	75 ± 0,04	96 ± 0,03	110 ± 0,02

зец ККГ 3-60 и ККГ 3-45) протекало интенсивнее, чем в остальных образцах. Так, через (6 ± 0,5) часов сквашивания титруемая кислотность смеси достигла (85 ± 2) °Т. Интенсивное нарастание титруемой кислотности позволяет сократить процесс сквашивания на 2–3 часа. Другие образцы сквашивались гораздо медленнее, рекомендуемый уровень титруемой кислотности (85 °Т) в сгустках ККГ 5-30 и ККГ+КЗ 5-30 был достигнут через (9 ± 0,5) часов сквашивания.

УЗВ высокой мощности обеспечивает дисперсность молочной системы и, как следствие, биодоступность белков молока к действию бактериальных ферментов. Развитие заквасочной микрофлоры и активность ферментов зависят от рН. Оптимальное значение рН для сквашенных продуктов на отдельных этапах производства составляет: начало охлаждения – 4,6–4,7; начало перемешивания 4,2– 4,6; готовый продукт 4,0–4,4. Активная кислотность образцов кефира в конце сквашивания (рис. 2) достигла оптимума для всех напитков на закваске кефирного грибка (ККГ) и заквасочной смеси (ККГ+КЗ). Органолептические свойства, в том числе консистенция кисломолочных напитков, взаимосвязаны с показателем активной кислотности (рН).

Структурно-механические свойства, влагоудерживающая способность, синергетические свойства зависят в большей степени от состава молока, режимов тепловой и механической обработки. Применение ультразвуковой кавитации на этапе подготовки молочного сырья к сквашиванию повлияло на устойчи- вость сгустка к самопроизвольному уплотнению структуры.

Так, динамика отделения сыворотки от сгустка (рис. 3) имела различную скорость, особенно это проявилось в первые 30 мин наблюдений. Средний прирост объема составлял для контроля от 5,5 до 9 мл, сгусток с режимом обработки УЗВ 3-60 для всех видов заквасок в первые пятнадцать минут слабо удерживал сыворотку, объем истечения 17 мл для ККГ и 13 мл для ККГ+КЗ.

В последующие периоды объем истечения находился в диапазоне от 4 до 2 мл. Наибольший объем отделившейся сыворотки был у образцов, молоко для которых обрабатывалось в режиме УЗВ мощность 60 %, длительность 3 минуты. Из приведенных данных видно, что применение УЗВ в режиме 3 минуты при 30 % мощности для обработки сырого молока в технологии ККГ снизило отделение сыворотки от сгустка в 1,4 раза, а для ККГ+КЗ – в 1,5 раза.

При микрокопировании экспериментальных образцов наблюдалась типичная для данных видов заквасок микрофлора, посторонних микроорганизмов не обнаружено. Вместе с тем, при микроскопировании фиксированных препаратов выявлено, что сгустки, полученные на основе симбиотической закваски КГ, характеризуются однородной консистенцией с меньшими агрегатами молочного белка и большим количеством комплексов белка небольшого размера, по сравнению с образцами, полученным на основе комбинированной закваски ККГ+КЗ, содержащий культуры

_____________________ режим обработки

W Г     гл V V Г—V ч

ЛЛх.1                АЗ

Рис. 2. Зависимость активной кислотности (pH) от состава закваски и режимов УЗВ, усл. ед.

время истечения.мин

— - - контроль ККГ -.е.- 5-3(i ККГ

контроль ККГ+К5

5-30 ККГ+К5

■ 5-30 ККГ

— ■ —5-30 ККГ+КЗ

■"””^^”*3-60 ККГ

*■■ 3 60 ККГ+КЗ

Рис. 3. Динамика синерезиса сгустков кефиров, полученных при различных режимах УЗВ, мл

Основными морфологическими типами микрофлоры в исследованных образцах являлись стрептококки, диплококки, палочки, дрожжи. Дрожжи существенно преобладали над кокковой микрофлорой по мере увеличения мощности УЗВ. В образцах кефира дрож- жи присутствовали практически в каждом поле зрения, в отличие от кефирного продукта, полученного на основе комбинированной закваски. При выработке кефира с использованием грибковой закваски уровни БГКП и S. aureus во время сквашивания и созревания не увеличивались.

Исследование дисперсной системы кисломолочных напитков показало, что образцы

Таблица 3

Микрофотографии образцов кефирных сгустков (окраска комбинированным фиксатором метиленовым синим, увеличение 90×15)

и a

ККГ 3-45 и ККГ 3-60 отличались зернистыми комплексами молочного белка, образующих в общей массе продукта неоднородные зоны большей или меньшей плотности, сгруппированные как в небольшие комплексы, так и в крупные агрегаты.

Динамика накопления кефирана в кисломолочных напитках находится в прямой зависимости от режимов УЗВ и активности заквасочных культур. Так, при приготовлении кисломолочных напитков с использованием закваски КГ количество кефирана составляет 164,24…204,94 мкг/г. В напитках, полученных на комбинированной закваске ККГ+ЗК продуцируется кефирана меньше и его содержание колеблется в диапазоне 187,7–190,7. На рис. 4 наглядно отражено влияние экспозиции УЗВ на накопление ЭПС, кривые линий тренда имеют разную степень кривизны, но, тем не менее, коррелируют с кривыми вязкости.

Структурные характеристики кисломолочных напитков обусловлены дисперсностью белковых частиц, структурой сгустков и их устойчивостью. Известно, что структура кефиров представляет собой крупные сгустки белковых частиц с вязкостью в диапазоне 30– 90 mPa. В наших исследованиях значения показателя вязкости варьировало в диапазоне 58,5 до 149 mPa в образцах кефира на КГ и в диапазоне от 74,3 до 100,19 mPa в образцах кисломолочных напитков, полученных сквашиванием на комбинированной закваске ККГ+КЗ.

Следовательно, можно полагать, что накопление растворимых полисахаридов в кисломолочных напитках как фактора, определяющего их функциональные свойства, необходимо регулировать. Возможно, за счет эффектов ультразвукового воздействия. В связи с чем последующие исследования были направлены на поиск путей регулирования процессов формирования потребительских свойств кисломолочных напитков, а также процессов накопления кефирана при наращивании микробной биомассы кефирного грибка.

Заключение

В процессе исследования было доказано, что применение кавитационных эффектов в модернизации технологии восстановленных продуктов переработки молока, повышение их качества, улучшение функциональных свойств продукта. Данные, полученные в ходе работы, дают основание для рекомендации использования кавитационного ультразвуко- вого реактора в технологии йогуртовых продуктов. Это будет являться новым подходом, позволяющим обеспечить потребителей функциональной продукцией высокого качества.