Влияние Alu-инсерций на метаболизм липидов

Alu-элементы – короткие диспергированные повторяющиеся последовательности ДНК, доля которых в геноме человека составляет около 10.6% от объема [2]. Длина типичного Alu-элемента около 300 пар нуклеотидов. «Современные» Alu-повторы классифицируют в соответствии с их возрастом. Выделяют 3 основных субсемейства Alu: Alu J , Alu S , Alu Y. Считается, что Alu Y — самое «молодое» субсемейство, средний возраст его представителей около 5 млн лет. Они до сих пор активны в отдельных семействах человекообразных приматов и потому полиморфны. В геноме человека большая часть Alu-инсерций приходится именно на субсемейство Alu Y или его производные. Из них наиболее представлены Alu Ya5 и Alu Yb8 подсемейства [2, 3]. В настоящее время ведется активный поиск Alu-элементов, которые могут быть задействованы в развитии тех или иных физиологических и психических признаков человека, а также их нарушений [5]. Ряд свойств полиморфных Alu-локусов, такие как их повсеместная распространенность в геноме, известное направление мутации, легкость генотипирования, делают их очень удобными генетическими маркерами [3, 4]. В данной работе поставлена цель изучить возможное влияние трех Alu-инсерций (в гене ангиотензин-превращающего фермента ACE , в генах АТФ-связывающих кассетных транспортеров субсемейства А: ABCA6 и ABCA10 ) на метаболизм липидов в организме человека и на параметры липидного профиля.

Ангиотензин-превращающий фермент представляет собой интегральный мембранный полипептид длиной 1306 АК, являющийся одним из ключевых компонентов ренин-ангиотензиновой системы, отвечающей за превращение ангиотензина I в ангиотензин II, являющийся основным сосудосуживающим агентом. Участвует в поддержании водно-солевого гомеостаза организма, питании и

стимуляции клеток гладкой мускулатуры сосудов и миокарда. Ген АСЕ картирован на хромосоме 17 (17q23), содержит 26 экзонов и 25 интронов. В 16 интроне гена находится полиморфный Alu-элемент Ya5NBC102 [15, 18].

АТФ-связывающие кассетные транспортеры (ABC), к которым относятся ABCA6 и ABCA10, образуют одно из самых крупных и самых консервативных суперсемейств трансмембранных белков, встречающихся во всех живых организмах. Исходя из структурного сходства и гомологии последовательностей, эукариотические ABC-белки разделяют на 8 различных подсемейств (от ABCA до ABCH), 7 из которых (от ABCA до ABCG) представлены в геноме человека [10, 17]. Большинство АТФ-связывающих кассетных транспортеров участвует в АТФ-зависимом переносе различных молекул, таких как аминокислоты, сахара и липиды через биологические мембраны [9, 10, 17]. Они осуществляют свое действие благодаря наличию в своем составе специфических сайтов, позволяющих осуществлять транспорт через мембрану клетки. Между собой ABC-траспортеры различаются трансмембранными доменами, в то время как АТФ-связывающие домены являются высококонсервативной структурой, гомологичной для всех белков этого типа [14].

Гены ABCA6 и ABCA10 локализованы на 17 хромосоме в локусе q24.2-3, входят в состав уникального кластера генов AТФ-связывающих кассетных транспортеров человека, расположенного на 17 хромосоме и включающего в себя гены ABCA5, ABCA6, ABCA8 и ABCA9 и ABCA10 [20]. Размер гена ABCA6 около 62 kb, состоит из 39 экзонов и 38 интронов. Экспрессируется повсеместно, но более всего в печени, легких, сердце. В 25 интроне этого гена располагается Alu-элемент Ya5_435 [18]. Белок ABCA6 представляет собой полипептид из 1617 аминокислот [11, 20]. Исходя из особенностей строения, предполагают, что ABCA6 также задействован в поддержании липидного гомеостаза посредством макрофагов [8]. В состав гена АТФ-связывающего кассетного транспортера ABCA10 входят 39 интронов и 40 экзонов, размер составляет около 97 kb. Топология его экспрессии совпадает с таковой у ABCA6. Белковый продукт гена состоит из 1543 аминокислот и имеет высокую гомологию с аминокислотной последовательностью кассетного транспортера ABCA6 [19]. Свойства и роль АТФ-связывающих кассетных переносчиков ABCA6 и ABCA10 изучены недостаточно.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

При изучении инсерционно-делеционного полиморфизма локусов, содержащих Alu-элементы Ya5NBC102, Ya5_435, Yb8NBC48, обследованы 316 человек в возрасте от 18 до 65 лет, проживающие на территории РБ. По показаниям липидного профиля они разделены на группы, в соответствии с рекомендациями Комитета экспертов Всероссийского научного общества кардиологов, составленные с учетом Европейских рекомендаций III пересмотра, 2003 г.: значения уровня общего холестерина (ОХС) выше 5.2 ммоль/л (N=51) считали высокими, ниже этого значения – нормой (N=265); значения уровня триглицеридов (ТГ) более 1.7 ммоль/л считали высокими (N=38), ниже – нормой (N=278); значения уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) более 3.35 ммоль/л считали высокими (N=35), ниже этого значения – нормой (N=281); низкий уровень ЛПВП считали таковым, если он был ниже 0.9 ммоль/л (N=36), уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) от 0.9 до 1.8 ммоль/л (N=216) определяли как норму, уровень ЛПВП более 1.8 ммоль/л считали высоким (N=64).

Для определения концентрации ОХС, ТГ, ЛПВП в плазме крови использовали наборы фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск). Концентрацию ЛПНП рассчитывали по формуле Фридвальда: ЛПНП=ОХС-ЛПВП-ТГ /2,2 [6]. Для расчета повышенного риска развития атеросклероза и заболеваний сердечно-сосудистой системы рассчитывали индекс атерогенности (ИА) по формуле Климова: ИА=ОХС-ЛПНП/ЛПВП [1]. Прогноз с ИА выше 3 считали неблагоприятным.

ДНК испытуемых была выделена из периферической крови человека стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [12] с их добровольного письменного согласия. Для полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) использовали праймеры, синтезированные фирмой «Евроген» (Москва). Данные по праймерам для детекции Alu-элементов в генах ACE, ABCA6, ABCA10 были взяты из базы данных инсерционного полиморфизма ретротранспозонов dbRIP [18]. Последовательности праймеров представлены в таблице.

Таблица. Последовательности праймеров для ПЦР

Реакционная смесь на 1 образец включала в себя 0,9 мкл буфера для Taq-полимеразы (SybEnzime, Новосибирск), смесь динуклеотидтрифосфатов (SybEnzime, Новосибирск) объемом 0,7 мкл, по 2 мкл разведенных праймеров, деионизированную воду 3,2 мкл, Taq-полимеразу (SybEnzime, Новосибирск) 0,2 мкл и образец ДНК-1 мкл. Продукты амплификации анализировались путем проведения электрофореза в 1,5% агарозном геле. Буфером для электрофоретической реакции являлся 1х TBE.

Визуализацию ДНК проводили в ультрафиолетовом свете трансиллюминатора.

Статистическая обработка данных, полученных в ходе генотипирования Alu-инсерции в гене ABCA6 и оценки индивидуальных параметров липидного профиля испытуемых, проводилась с использованием программ STATISTICA v.6.0, MS Excel 2003, GENEPOP v.1.2 и RxC.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов между группами с разными значениями липидного профиля использовали критерий χ2 с поправкой Йетса для небольших выборок. Различия считали достоверными при уровне значимости ρ<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку AТФ-связывающий кассетный переносчик ABCA6 задействован в транспортировке различных субстратов через биологические мембраны [8,14] и исходя из его близкого родства с ABCA1 , играющего важную роль в оттоке холестерина и фосфолипидов из макрофагов [10], мы предположили, что Alu-инсерция Ya5_435 в гене ABCA6 оказывает определенное влияние на метаболизм липидов. Для подтверждения этой гипотезы изучили влияние Alu-инсерции Ya5_435 на показатели липидного профиля. При рассмотрении влияния Alu-инсерции в гене ABCA6 на уровень ОХС и ЛПНП статистически значимых различий выявлено не было. В группе с высокими показателями ТГ частота генотипа ABCA6*D/*D была достоверно выше, чем в группе, где этот показатель находился в норме (55.27±8.06% против 33.45±2.82%; χ²=5.98; ρ=0.015; OR=2.45; 95%CL=1.17-5.15). Соответственно, наблюдали достоверное увеличение частоты носительства аллеля ABCA6*D в группе с высоким уровнем ТГ и уменьшение частоты аллеля ABCA6*I (76.32±4.87 против 60.07±2.07; х 2 =6-81; Р = 0.009 ;

OR=2.14; 95%CL=1.19-3.88). Таким образом, ин-серция Alu-элемента в ген ABCA6 может приводить к снижению, а ее отсутствие – к повышению уровня триглицеридов в плазме крови, одного из основных источников энергии для организма человека.

При сравнении групп с низким и нормальным уровнем ЛПВП наблюдали достоверное увеличение частоты генотипа ABCA6*I/*I в группе с низким уровнем ЛПВП (25±7.22% против 10.65±2.09%; χ²=4.51; ρ=0.034; OR=2.79; 95%CL=1.07-7.19). Соответственно, в изучаемых группах наблюдалось статистически значимое различие в частоте аллелей. В группе с низким уровнем ЛПВП носители аллеля ABCA6*I наблюдались достоверно чаще (51.38±5.89% против 35.88±2.31%; χ²=5.654; ρ=0.018; OR=1.89; 95%CL=1.11-3.21). Провели также сравнение групп с низким и высоким уровнем ЛПВП, в целом подтвердившее данные о том, что носительство генотипа ABCA6*I/*I чаще встречается в группе с низким уровнем ЛПВП. Полученные значения были близки статистически значимым (25±7.22% в группе с низким уровнем ЛПВП против 9.375±3.64 в группе с высоким уровнем; χ²=3.27; ρ=0.07; OR=3.22; 95%CL=0.92-11.54). Анализ распределения частот аллелей подтвердил, что частота аллеля ABCA6*I в группе с низким уровнем ЛПВП выше, чем в группе с высоким уровнем ЛПВП (51.38±5.89% против 37.5±4.28%; χ²=3.09; ρ=0.078; OR=1.76; 95%CL=0.94-3.30). Поскольку низкий уровень ЛПВП является одним из неблагоприятных атерогенных факторов, а также заболеваний сердца и сосудов, для всех изученных индивидуумов был рассчитан ИА, в соответствии со значениями которого они были разделены на 2 группы: группа с благоприятным прогнозом и группа повышенного риска. Носительство генотипа ABCA6*I/*I чаще наблюдалось в группе повышенного риска, чем в группе с благоприятным прогнозом (20.83±4.78% против 9.31±1.85%; χ²=5.99; ρ=0.015; OR=2.56; 95%CL=1.18-5.52). Также было показано, что носители аллеля ABCA6*I встречаются достоверно чаще, а аллель ABCA6*D достоверно реже в группе людей с высокими значениями индекса атерогенности, чем в группе людей с индексом атерогенности ниже 3 (46.53±4.16% против 35.02±2.15%; χ²=5.811; ρ=0.016; OR=1.615; 95%CL=1.089-2.393). Таким образом, инсерция Alu-элемента Ya5_435 в ген АТФ-связывающего кассетного переносчика ABCA6 может вести к повышению риска развития атеросклеротических отложений на стенках сосудов и заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Исходя из высокого уровня гомологии белка ABCA10 с белком ABCA6, мы надеялись, что он обладает сходными с ним функциями. Однако анализ ассоциаций инсерции Alu-элемента Yb8NBC48 в гене ABCA10 не выявил статистически значимого влияния на параметры липидного профиля. При проведении генотипирования также не было выяв- лено генотипа ABCA10*I/*I. Однако частота генотипа ABCA10*I/*D в группе с людей с благоприятным прогнозом по развитию атеросклероза была достоверно больше таковой, чем в группе, где прогноз был неблагоприятен (65.58±3.02% против 49.27±6.01%; χ2=5.42; ρ=0.02; OR=1.96; 95%CL=1.10-3.48). Частота генотипа ABCA10* D /*D была достоверно ниже в группе с низкими значениями ИА, чем в группе с высокими (34.42±3.02% против 50.73±6.01%; χ2=5.42; ρ=0.02; OR=0.51; 95%CL=0.29-0.91). Различия в частотах аллелей были близки статистически значимым. При этом частота аллеля ABCA10*D была несколько ниже в группе с низким уровнем ИА (67.21±2.1% против 75.36±3.67%; χ2=2.98; ρ=0.08; OR=0.67; 95%CL=0.43-1.05). Возможно, полученные значения обусловлены лишь косвенным влиянием инсерции Alu-элемента в гене ABCA10 на метаболизм липидов, а точнее тем, что они являются неспецифическими субстратами для ABCA10.

При изучении влияния инсерции Ya5NBC102 в гене ангиотензин-превращающего фермента ACE на ОХС, ТГ, ЛПНП и ИА не было выявлено статистически достоверных значений. Однако сравнение групп с нормальными и низкими значениями уровня ЛПВП таковые выявило. Частота генотипа ACE*I/*I в группе с нормальными значениями уровня ЛПВП была достоверно ниже, чем в группе с низким уровнем ЛПВП (20.83±2.76% против 41.67±8.21%; χ²=2.98; ρ=0.013; OR=6.28; 95%CL=0.17-0.82). При этом частота генотипа ACE*I/*D была достоверно выше в группе с нормальным уровнем ЛПВП (59.26±3.34% против 38.89±8.22%; χ²=4.41; ρ=0.036; OR=2.29; 95%CL=1.05-5.01). Однако сравнение частот аллелей ACE*I и ACE*D в этих группах не выявило достоверных различий. Для подтверждения влияния гена ACE на уровень ЛПВП провели сравнение частот генотипов и аллелей в группах с низким и высоким уровнем ЛПВП. При этом была выявлена тенденция к увеличению частоты генотипа ACE*I/*I в группе с низкими значениями уровня ЛПВП, по сравнению с группой с высокими показателями (41.67±8.21% против 21.875±5.17%; χ²=3.47; ρ=0.06; OR=2.55; 95%CL=0.96-6.83). Таким образом, инсерция Alu-элемента в ген ACE может оказывать некоторое влияние на уровень ЛПВП, что является одним из факторов риска при заболеваниях сердца и сосудов.

Заболевания сердца и сосудов на сегодняшний день входят в число самых распространенных и опасных для здоровья человека болезней. Значительное влияние на риск их развития оказывает образ жизни человека и условия окружающей среды. Однако гораздо больший вклад в этот процесс вносит наследственная предрасположенность к нарушениям в метаболизме липидов. Нами показано, что инсерция Alu-элемента Ya5_435 в ген АТФ-связывающего кассетного транспортера ABCA6 может приводить к изменению уровня триглицери- дов и уменьшению уровня липопротеидов высокой плотности. Недостаточное количество последнего является одним из факторов, способствующих развитию атеросклеротических отложений на стенках сосудов и повышению риска развития сердечнососудистых заболеваний. Гомозиготное носительство инсерции Alu-элемента (генотип ABCA6*I/*I) в гене кассетного переносчика ABCA6 ассоциировано со снижением уровня ЛПВП и может оказывать влияние на риск развития атеросклероза. Возможно, при генотипе ABCA6*I/*D значительное компенсаторное действие оказывает аллель ABCA6*D, то при гомозиготном носительстве Alu-инсерции в этом кассетном переносчике такое влияние отсутствует, и он работает некорректно. Также показано, что инсерция Alu-элемента в гене ABCA10 чаще встречается в группе с низкими значениями ИА, и, следовательно, может обладать некоторым антиатерогенным эффектом. Гомозиготный по инсерции генотип ACE*I/*I ассоциирован с уменьшением уровня ЛПВП, что может влиять на возможность развития болезней сосудов и сердца.

Полученные в ходе данной работы результаты можно объяснить тем, что организм человека является сложной системой взаимодействующих между собой генов. Инсерция Alu-элемента в какой-либо ген способна оказать влияние на всю систему в целом.