Влияние анти-антител к эстрадиолу и прогестерону на содержание гормонов в сыворотке крови здоровых женщин и больных раком молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) остаётся ведущим злокачественным новообразованием у женщин, заболеваемость которым растёт в РФ и мире [1]. Разработка новых методов определения индивидуальных рисков возникновения для последующей профилактики РМЖ возможна путём изучения неизвестных ранее механизмов малигнизации клеток молочной железы. Роль стероидных гормонов в патогенезе РМЖ хорошо известна. Показано, что эстрадиол (Es) стимулирует пролиферацию клеток-мишеней, т.е. действует как промотор канцерогенеза, а прогестерон (Pg) обладает противоположным действием, т.е. выступает как антипромотор [2, 3]. Кроме того, метаболиты Es способны формировать ковалентные аддукты с ДНК, инициируя мутации [4].

С другой стороны, было показано, что иммунизация животных против Es и Pg приводила к появлению специфических антител и повышению концентрации гормонов в сыворотке крови [5–8]. После иммунизации мышей против Es наблюдали замедление возникновения и роста имплантированных Es-зависимых опухолей молочной железы, по предположению авторов, за счёт связывания Es антителами [9]. Поэтому изучение механизмов иммунорегуляции содержания стероидных гормонов в норме и при патологии молочной железы представляют определенный интерес.

Ранее нами были выявлены ассоциации антител, специфичных к Es и Pg с РМЖ у женщин в постменопаузе [10]. Содержание Es и Pg в сыворотке крови здоровых женщин и больных РМЖ было взаимосвязано с уровнями специфических антител [11]. Вместе с тем у здоровых женщин и больных РМЖ были обнаружены антиидиотипические антитела к Es и Pg [12]. Ранее описанные аутоантитела, специфичные к Es-рецептору, ассоциированные с пролиферацией клеток РМЖ [13], вероятно, тоже представляли собой антиидиотипические антитела к Es. Однако влияние таких антител на содержание стероидных гормонов в сыворотке крови человека остаётся неизученным.

Цель исследования – изучить влияние анти-идиотипических антител к Es и Pg на содержание гормонов в сыворотке крови здоровых женщин и больных РМЖ в сравнении с соответствующими идиотипическими антителами.

Материал и методы

В исследование были включены 686 женщин в постменопаузе, в том числе 480 с диагнозом инвазивная карцинома молочной железы, поступивших на лечение в Областной клинический онкологический диспансер (г. Кемерово). Диагноз РМЖ в каждом случае был подтвержден морфологически. В большинстве случаев были выявлены I и II стадии заболевания – в 36,0 % и 46,5 %, III и IV стадии – в 17,1 % и 0,4 % наблюдениях соответственно. Медиана возраста – 62 года (интерквартильный размах – 57–69 лет).

В группу сравнения были включены 206 условно здоровых женщин, проживающих на территории Кемеровской области, и доноры Кемеровского центра крови без патологии молочной железы. Медиана возраста – 57 лет (интерквартильный размах – 54–60 лет).

Забор периферической крови осуществлялся согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.03. Все женщины, участвовавшие в исследовании, дали информированное письменное согласие.

Определение идиотипических антител к Es и Pg (IgА-Es1, IgА-Pg1, IgG-Es1, IgG-Pg1) проводили с помощью неконкурентного иммунофер-ментного анализа, как описано в [10]. В качестве антигенов на полистирольные иммунологические планшеты были иммобилизованы конъюгаты Es и Pg с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Конъюгат Es-BSA был синтезирован путем присоединения BSA к эстрадиолхинонам, полученным окислением Es солью Фреми. Конъюгат Pg-BSA был получен путем конъюгации гемиглутарата 21-гидроксипрогестерона и BSA карбодиимид-ным способом. Иммунологические планшеты сенсибилизировали конъюгатами гаптен-BSA в течение ночи при комнатной температуре. Образцы сыворотки крови в разведении 1:20 (для определения IgA антител) или 1:100 (для определения IgG антител) вносили по 100 мкл в лунки планшета в дублях, инкубировали 1 ч при 37 °С на шейкере. Cвязавшиеся антитела выявляли с помощью козьих антител против IgА(G) человека, меченных пероксидазой хрена (Novex, США), разведение конъюгата 1:10 000. В лунки вносили по 100 мкл меченых антител и инкубировали 1 ч при 37°С на шейкере. Регистрацию адсорбированных на планшете антител проводили с помощью субстратного буфера, содержащего тетраметилбензидин (TMB, США), на фотометре (Униплан, Россия) при длине волны 450 нм. Уровни антител выражали в относительных единицах и вычисляли по формуле

IgА(G)-X=(ODX-BSA-ODBSA)/ODBSA, где X=Es, Pg; ODX-BSA – связывание антител с конъюгатом гаптен-BSA, ODBSA – фоновое связывание с BSA.

Анализ антиидиотипических антител к Es и Pg (IgG-Es2, IgG-Pg2) осуществляли на коммерческих наборах «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» («Иммунотех», г. Москва) с иммобилизованными на пластике моноклональными антителами против Es и Pg согласно ранее описанной методике [14]. Уровни антиидиотипических антител также выражали в относительных единицах и рассчитывали по отношению связывания сывороточных антител с иммобилизованными на пластике антителами к Es и Pg (за вычетом фонового связывания с отрицательным контролем) к отрицательному контролю.

Концентрацию стероидных гормонов (Es, Pg) определяли с помощью коммерческих наборов «ИммуноФА-Эстрадиол», «ИммуноФА-ПГ» («Иммунотех», г. Москва) согласно инструкции по применению.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft Inc., USA). Ненормальный характер распределения показателей выявили с помощью критерия Шапиро – Уилка и в дальнейшем для выявления различий между группами использовали непараметрический критерий χ2 с поправкой Йейтса на непрерывность вариации. За критический уровень значимости принималось значение p<0,05. Для выявления пороговых значений концентраций гормонов и уровней антител (cut-off) был проведен ROC-анализ [15]. Ассоциации исследуемых антител и стероидных гормонов с РМЖ оценивали на основании величины отношения шансов (odds ratio, ОR) с доверительным интервалом (CI) при 95 % уровне значимости.

Результаты и обсуждение

Сначала с помощью ROC-анализа определили пограничные значения концентраций Es и Pg, по которым сравниваемые группы имели наибольшие различия. В табл. 1 представлено распределение случаев с низким (≤) и высоким (>) содержанием этих гормонов и их соотношением (Pg/Es) в сыворотке крови здоровых женщин и больных РМЖ в постменопаузе. Частота встречаемости высоких уровней Es (>200 pmol/L) у здоровых женщин

(43,2 %) оказалась ниже, чем у больных (68,8 %, OR=2,9). Высокое содержание Pg (>800 pmol/L) у здоровых женщин обнаруживали чаще (61,2 %), чем у больных РМЖ (40,0 %, OR=0,4). Поэтому и высокие значения индивидуальных соотношений Pg/Es (>4,0) у здоровых женщин выявлялись чаще (56,8 %), чем у больных (30,6 %, OR=0,3). Полученный результат соответствует известным данным о стимулирующем пролиферацию клеток молочной железы действии Es и угнетающем – Pg [2, 3].

Очевидно, что индивидуальное соотношение Pg/Es как комплексный показатель отражает участие этих гормонов в процессах инициации и промоции канцерогенеза в молочной железе в большей степени, чем каждого из них по отдельности. Значительное превалирование уровня Pg над уровнем Es (Pg/Es>4,0) условно обозначили как «физиологический гормональный баланс», препятствующий избыточной пролиферации клеток-мишеней, риск возникновения РМЖ в этом случае низкий (OR=0,3). Нарушение баланса в пользу Es (Pg/Es<4,0) создаёт условия для стимуляции инициирующих и промоторных эффектов Es, повышая риск РМЖ (OR=3,0). Такое состояние условно обозначили как «проканцерогенный гормональный дисбаланс».

Таблица 1/Table 1

Число и частота встречаемости случаев с низким ( ≤ ) и высоким (>) содержанием эстрадиола (Es), прогестерона (Pg) (pmol/L) и соотношением Pg/Es в сыворотке крови здоровых женщин и больных раком молочной железы

Cases numbers and frequencies with low ( ≤ ) and high (>) Es and Pg concentrations (pmol/L) and Pg/Es ratios in the blood serum of breast cancer patients (BCP) and healthy women (HW)

Гормоны, соотношение гормонов/ Hormones, hormone ratio	РМЖ/BCP (n=480)	Здоровые/Health (n=206)	χ2(р)	OR (95%CI)
Es≤200 Es>200	150 (31,3 %) 330 (68,8 %)	117 (56,8 %) 89 (43,2 %)	38,50 (<0,0001)	0,35 (0,25–0,48) 2,89 (2,07–4,05)
Pg≤800 Pg>800	288 (60,0 %) 192 (40,0 %)	80 (38,8 %) 126 (61,2 %)	25,1 (<0,0001)	2,36 (1,69–3,30) 0,42 (0,30–0,59)
Pg/Es ≤4,0 Pg/Es>4,0	333 (69,4 %) 147 (30,6 %)	89 (43,2 %) 117 (56,8 %)	40,6 (<0,0001)	2,98 (2,13–4,17) 0,33 (0,24–0,47)

Таблица 2/Table 2

Число и частота встречаемости случаев с низким ( ≤ ) и высоким (>) содержанием эстрадиола (Es), прогестерона (Pg) (pmol/L) и их соотношением Pg/Es при разных значениях соотношений исследуемых антител в сыворотке крови здоровых женщин

Cases number and frequencies of the low ( ≤ ) and high (>) Es and Pg (pmol/l) concentration and Pg/Es ratio at the different ratios of studied antibodies in the blood serum of healthy women

Соотношения антител/ Antibody ratios	Es		Pg		Pg/Es
	≤ 200	> 200	≤ 800	> 800	≤ 4,0	> 4,0
Идиотипические антитела/Idiotypic antibodies
1.1 IgA-Pg1/IgA-Es1 <0,5	24 (41,4 %)	34 (58,6 %)	29 (50,0 %)	29 (50,0 %)	32 (55,2 %)	26 (44,8 %)
1.2 IgA-Pg1/IgA-Es1 0,5–1,0	66 (60,0 %)	44 (40,0 %)	45 (40,9 %)	65 (59,1 %)	49 (44,5 %)	61 (55,5 %)
1.3 IgA-Pg1/IgA-Es1 >1,0	27 (71,0 %)	11 (28,9 %)	6 (15,8 %)	32 (84,2 %)	8 (21,1 %)	30 (78,9 %)
χ2 (p), df=2	9,23 (0,010)		11,74 (0,003)		11,07 (0,004)
2.1 IgG-Pg1/IgG-Es1 <0,5	37 (53,6 %)	32 (46,4 %)	33 (47,8 %)	36 (52,2 %)	35 (50,7 %)	34 (49,3 %)
2.2 IgG-Pg1/IgG-Es1 0,5–1,0	72 (59,0 %)	50 (41,0 %)	44 (36,1 %)	78 (63,9 %)	48 (39,3 %)	74 (60,7 %)
2.3 IgG-Pg1/IgG-Es1 >1,0	8 (53,3 %)	7 (46,7 %)	3 (20,0 %)	12 (80,0 %)	6 (40,0 %)	9 (60,0 %)
χ2 (p), df=2	0,60 (0,741)		4,98 (0,083)		2,39 (0,303)
Антиидиотипические антитела/Antiidiotypic antibodies
3.1 IgG-Pg2/IgG-Es2 <0,5	84 (59,6 %)	57 (40,4 %)	60 (42,6 %)	81 (57,4 %)	62 (44,0 %)	79 (56,0 %)
3.2 IgG-Pg2/IgG-Es2 0,5–1,0	10 (31,3 %)	22 (68,8 %)	17 (53,1 %)	15 (46,9 %)	22 (68,8 %)	10 (31,3 %)
3.3 IgG-Pg2/IgG-Es2 >1,0	23 (69,7 %)	10 (30,3 %)	3 (9,1 %)	30 (90,9 %)	5 (15,2 %)	28 (84,8 %)

χ2(p), df=2                     11,19 (0,004)                   15,86 (<0,001)                   19,3 (<0,001)

Учитывая вышеприведённые экспериментальные данные о влиянии специфических антител на содержание стероидных гормонов у иммунизированных животных, изучение влияния индивидуальных соотношений специфических аутоантител к Es и Pg на гормональный баланс в норме и при гормонозависимых опухолях у человека представляет особый интерес. В настоящей работе мы исследовали частоту встречаемости случаев с низким и высоким содержанием Es и Pg и их соотношением Pg/Es при разных значениях соотношений идиотипических и антиидиотипических антител в сыворотке крови здоровых женщин и больных РМЖ.

У здоровых женщин (табл. 2) обнаружили взаимосвязи Es, Pg и Pg/Es с соотношением идиотипических антител класса А. Возрастание индивидуальных значений соотношения IgA-Pg1/ IgA-Es1 от <0,5 до >1,0 (позиции 1.1–1.3) было ассоциировано со снижением частоты встречаемости случаев с высокими уровнями Es (>200 pmol/L) с 58,6 % до 28,9 % (р=0,01). При этом доля случаев с высоким содержанием Pg (>800 pmol/L) возрастала с 50,0 % до 84,2 % (р=0,003) так же, как и высокое значение соотношения Pg/Es (>40) с 44,8 % до 78,9 % (р=0,004).

Искомые взаимосвязи с соотношением идиотипических антител класса G (позиции 2.1–2.3) не были выявлены.

При исследовании антиидиотипических антител класса G у здоровых женщин (позиции 3.1–3.3) частота встречаемости случаев с высо- ким содержанием Es была значительно выше при значениях IgG-Pg2/IgG-Es2 в интервале 0,51,0 (68,8 %, р=0,004), чем при низких значениях <0,5 (40,4 %) и высоких >1,0 (30,3 %). Высокие уровни Pg (>800 pmol/L) соответствовали высоким значениям соотношения IgG-Pg2/IgG-Es2 (>1,0) (90,9 %) по сравнению с низкими значениями (57,4 % и 46,9 %, р<0,001) так же, как и высокие значения Pg/Es (84,8 %, 56,0 % и 31,3 % соответственно, р<0,001).

Таким образом, состояние физиологического гормонального баланса (Pg/Es>4,0) у здоровых женщин оказалось ассоциированным с высокими соотношениями идиотипических антител (IgA-Pg1/IgA-Es1>1,0), а проканцерогенного дисбаланса (Pg/Es<4,0) – с низким соотношением (<1,0). Гормональный баланс был ассоциирован с низким (<0,5) или высоким (>1,0) соотношением антиидиотипических антител IgG-Pg2/IgG-Es2. Проканцерогенный дисбаланс имел место при промежуточных значениях IgG-Pg2/IgG-Es2 (0,51,0).

При РМЖ (табл. 3) не обнаружено значимых взаимосвязей между идиотипическими антителами и гормональным статусом (позиции 1.1–1.3 и 2.1–2.3). Только при соотношении антиидиоти-пических антител IgG-Pg2/IgG-Es2 в интервале 0,5–1,0 было больше случаев (79,0 %) с высоким содержанием в сыворотке крови Es по сравнению с другими интервалами (<0,5 и >1,0; 61,8 % и 63,2 % соответственно, р<0,001). Взаимосвязи Pg и Pg/ Es с IgG-Pg2/IgG-Es2 оказались слабо значимыми (р=0,04).

Таблица 3/Table 3

Число и частота встречаемости случаев с низким ( ≤ ) и высоким (>) содержанием эстрадиола (Es), прогестерона (Pg) (pmol/L) и их соотношением Pg/Es при разных значениях соотношений исследуемых антител в сыворотке женщин, больных раком молочной железы

Cases number (n) and frequencies (%) of the low ( ≤ ) and high (>) Es and Pg (pmol/l) concentration and Pg/Es ratio at the different ratios of studied antibodies in the blood serum of breast cancer patients

Соотношения антител/                 ^{Es                         Pg                        Pg/Es}

Antibody ratios	≤200	>200	≤800	>800	≤4,0	>4,0
Идиотипические антитела/Idiotypic antibodies
1.1 IgA-Pg1/IgA-Es1 <0,5	41 (33,3 %)	82 (66,7 %)	71 (57,7 %)	52 (42,3 %)	87 (70,7 %)	36 (29,3 %)
1.2 IgA-Pg1/IgA-Es1 0,5–1,0	83 (30,7 %)	187 (69,3 %)	169 (62,6 %)	101 (37,4 %)	189 (70,0 %)	81 (30,0 %)
1.3 IgA-Pg1/IgA-Es1 >1,0	26 (29,9 %)	61 (70,1 %)	48 (55,2 %)	39 (44,8 %)	57 (65,6 %)	30 (34,5 %)
χ2(p), df=2	0,36 (0,837)		1,87 (0,394)		0,77 (0,682)
2.1 IgG-Pg1/IgG-Es1 <0,5	36 (27,1 %)	97 (72,9 %)	85 (63,9 %)	48 (36,1 %)	99 (74,4 %)	34 (25,6 %)
2.2 IgG-Pg1/IgG-Es1 0,5–1,0	97 (34,8 %)	182 (65,2 %)	164 (58,8 %)	115 (41,2 %)	189 (67,7 %)	90 (32,3 %)
2.3 IgG-Pg1/IgG-Es1 >1,0	17 (25,0 %)	51 (75,0 %)	39 (57,4 %)	29 (42,6 %)	45 (66,2 %)	23 (33,8 %)
χ2(p), df=2	3,93 (0,141)		1,22 (0,544)		2,28 (0,320)
Антиидиотипические антитела/Antiidiotypic antibodies
3.1 IgG-Pg2/IgG-Es2 <0,5	76 (38,2 %)	123 (61,8 %)	107 (53,8 %)	92 (46,2 %)	127 (63,8 %)	72 (36,2 %)
3.2 IgG-Pg2/IgG-Es2 0,5–1,0	39 (21,0 %)	147 (79,0 %)	116 (62,4 %)	70 (37,6 %)	141 (75,8 %)	45 (24,2 %)
3.3 IgG-Pg2/IgG-Es2 >1,0	35 (36,8 %)	60 (63,2 %)	65 (68,4 %)	30 (31,6 %)	65 (68,4 %)	30 (31,6 %)
χ2(p), df=2	14,9 %)9 (<0,001)		6,4 %)6 (0,040)		6,55 (0,038)

Таким образом, состояние проканцерогенно-го гормонального дисбаланса у больных РМЖ может быть обусловлено отсутствием или сла-бовыраженным влиянием идиотипических и антиидиотипических антител к Es и Pg. Более того, при определённых условиях (IgG-Pg2/IgG-Es2 в интервале от 0,5 до 1,0) антиидиотипические антитела оказались ассоциированными с высоким содержанием Es в сыворотке крови у больных РМЖ. В этом случае возможна стимуляция канцерогенеза.

Заключение

Впервые обнаружено влияние антиидиоти-пических антител к Es и Pg на содержание этих гормонов в сыворотке крови здоровых женщин в постменопаузе. В частности, превалирование уровней IgG-Pg2 над уровнем IgG-Es2 оказалось ассоциированным с высокими значениями индивидуальных соотношений Pg/Es (р<0,001) за счет высокого содержания Pg. У больных РМЖ искомые взаимосвязи были статистически слабо значимыми. При этом повышенные уровни Pg и соотношения Pg/Es имели место при низких значениях IgG-Pg2/IgG-Es2<0,5 (р=0,04)