Влияние антиоксидантов на эффективность введения в культуру in vitro красной малины

Однако постоянно появляются новые перспективные сорта сельскохозяйственных культур, требующие включения их в биотехнологические процессы, как для научных исследований, так и для ускоренного размножения и оздоровления.

Введению в стерильную культуру посвящено много работ, в том числе рассматривающих этот процесс для растений рода Rubus [4-6]. Все исследователи отмечают, что успех его зависит от выбора экспланта, сроков его взятия, режимов стерилизации и культивирования, генотипа растений. Дополнительные трудности представляет повреждение эксплантов продуктами окисления фенолов, которые выделяются на месте среза растительных тканей [7]. Для снижения вредного воздействия проводят пересадки на свежие среды или используют антиоксиданты [8]. Задачей настоящего исследования являлись подбор антиоксидантов и их оптимальных концентраций для повышения результативности введения в культуру сортов красной малины.

Материалы и методы

Введение малины в искусственную культуру проводили по стандартной методике [6]. В качестве эксплантов были взяты апикальные и латеральные почки окончивших рост и частично одревесневших (август – начало сентября) побегов сортов красной малины Вольница и Беглянка.

Перед стерилизацией фрагменты растений тщательно промывали проточной водой со стиральным порошком, а затем ополаскивали дистиллированной водой. После ополаскивания удаляли кроющие чешуи и проводили стерилизацию 0,1%-м раствором сулемы (хлорид ртути) в течение 60 секунд. Затем экспланты вновь дважды ополаскивали проавтоклавирован-ной дистиллированной водой, после чего помещали в пробирки диаметром 21 мм с питательной средой.

Для введения в культуру использовали среду с минеральным составом и витаминами по прописи MS [9]. Среду MS модифицировали, уменьшая количество аммонийного и нитратного азота вдвое. В качестве источника углеводов использовали сахарозу в концентрации 20 г/л. Из экзо- генных регуляторов роста в питательную среду вносили 0,5 мг/л гибберелловой кислоты (ГК) и 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП).

Для снижения вредного воздействия продуктов окисления фенолов на развитие эксплантов в среды включали антиоксиданты: аскорбиновую кислоту, глутатион восстановленный и рутин в концентрациях 0,25, 0,5, 0,75 и 1 мМ. Контролем служила среда без антиоксидантов.

Через 3 недели после введения эксплантов в стерильную культуру образовавшиеся побеги пересаживали на среду для размножения. Состав среды для размножения отличался от среды для введения в культуру более высоким содержанием 6-БАП (0,5 мг/л).

Экспланты как на этапе введения в стерильную культуру, так и на этапе размножения культивировали при освещённости 2500 Лк, продолжительности светового дня 16 часов и температуре 23±2оС. Учитывали процент стерильных эксплантов, процент жизнеспособных эксплантов от числа стерильных, среднее число побегов в первом пассаже после переноса образовавшихся побегов на среду для размножения.

В каждом варианте опытов было использовано 3 биологических повторности по 30 эксплантов в каждой. Математическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с использованием статистического пакета программы Microsoft Excel.

Результаты исследований и обсуждение

В отношении сорта малины Вольница манипуляции по стерилизации материала и введению эксплантов в культуру проходили более успешно. Использование описанного выше режима стерилизации позволило получить у сорта Вольница 76,67±7,70% стерильных эксплантов. Из них число сохранивших жизнеспособность на средах без антиоксидантов достигало 65,02±1,02%. У сорта Беглянка число стерильных эксплантов составило 43,33±3,84%, из них жизнеспособность сохраняли лишь 40,03±6,38%.

Увеличение продолжительности стерилизации почек сулемой до 90 секунд увеличивало количество стерильных эксплантов у обоих сортов до 82,33-90,33%, но снижало их жизнеспособность до 5,1213,53%. Кроме того, после пересадки на среды для мультипликации коэффициенты размножения у сортов малины красной составляли всего 0,4-0,65. Вероятно, это является следствием повреждения тканей в процессе длительного контакта с ртутным препаратом. Поэтому увеличение продолжительности стерилизации нежелательно.

Внесение в питательные среды антиоксидантов в процессе введения в стерильную культуру позволило увеличить число жизнеспособных эксплантов. Высокую эффективность показали аскорбиновая кислота и глутатион восстановленный.

При использовании аскорбиновой кислоты в оптимальной концентрации, равной 0,75 мМ, количество жизнеспособных эксплантов малины сорта Вольница увеличилось на 29,11%, у сорта Беглянка этот показатель увеличился на 67,14% по сравнению с контролем (табл.). У обоих сортов различия по количеству жизнеспособных эксплантов на средах с аскорбиновой кислотой и контрольных средах подтверждаются статистически при уровне значимости нулевой гипотезы Р<0,05.

Меньшие концентрации витамина С (0,25 и 0,5 мМ) продемонстрировали не подтверждённую статистически тенденцию к увеличению количества жизнеспособных эксплантов. Увеличение концентрации аскорбиновой кислоты до 1 мМ не привело к увеличению числа жизнеспособных эксплантов по сравнению с концентрацией 0,75 мМ ни у одного из изученных сортов красной малины.

Было установлено, что в первом субкультивировании на средах мультипликации экспланты, которые на этапе введения в культуру подвергались воздействию аскорбиновой кислоты, демонстрировали статистически не подтверждённую тенденцию к увеличению коэффициентов размножения. У сорта Вольница коэффициент размножения увеличился на 10,3%, у сорта Беглянка – на 11,59% (табл.).

Оптимальные концентрации глутатиона восстановленного составили 0,25-0,5 мМ. Статистически подтверждённых различий по числу жизнеспособных эксплантов и коэффициентам размножения между названными вариантами концентраций не было обнаружено. Различия с контролем у названных вариантов математически существенны для сорта Беглянка, для второго сорта наблюдалась тенденция к увеличению жизнеспособности эксплантов и коэффициентов размножения под влиянием названного антиоксиданта. Применение глутатиона восстановленного в концентрации 0,5 мМ (130 мг/л) позволило повысить жизнеспособность эксплантов малины сорта Вольница в среднем на 12,23%, а эксплантов сорта Беглянка – на 45,72% (табл.). Коэффициент размножения в первом субкультивировании на среде мульти- пликации у подвергнутых воздействию глутатиона на этапе введения в культуру эксплантов малины Вольница увеличился на 11,52% по сравнению с контролем, а эксплантов сорта Белянка – на 30,43% (статистически существенное различие, Р<0,05).

Следует отметить, что сорт Беглянка, отличающийся в контроле более низкими показателями жизнеспособности после стерилизации ртутным препаратом, оказался более отзывчивым на внесение антиоксидантов.

Увеличение содержания глутатиона до 0,75 мМ и 1 мМ не привело ни к увеличению количества жизнеспособных эксплантов, ни к росту коэффициентов размножения по сравнению с оптимальными вариантами, хотя названные показатели имели значения выше, чем в контроле.

Таблица. Влияние оптимальных концентраций антиоксидантов на количество жизнеспособных эксплантов малины на этапе введения в стерильную культуру и коэффициент размножения в первом субкультивировании

Сорт	Вариант опыта	Количество стерильных эксплантов, %	Количество жизнеспособных эксплантов после стерилизации		Коэффициент размножения в первом субкультивировании на среде мультипликации
			шт.	%
Вольница	контроль	76,67±7,70	43	65,02±1,02	1,65±0,18
	0,75 мМ аскорбиновой кислоты	68,89±7,29	51	83,95±2,87	1,82±0,19
	0,5 мМ глутатиона восстановленного	78,11±5,57	50	71,03±3,06	1,84±0,66
Беглянка	контроль	43,33±3,83	16	40,03±6,38	1,38±0,26
	0,75 мМ аскорбиновой кислоты	40±8,39	34	66,91±7,34	1,55±0,26
	0,5 мМ глутатиона восстановленного	41,11±4,84	21	58,33±6.73	1,8±0,25

Применение рутина ни в одной из испытанных концентраций не продемонстрировало положительных результатов. Во всех вариантах опыта и процент жизнеспособных эксплантов, и коэффициент размножения в первом субкультивировании на среде мультипликации у обоих сортов статистически не отличались от названных показателей в контроле.

Заключение

Установлено, что при введении в культуру in vitro красной малины добавление в питательную среду антиоксидантов повышает количество эксплантов, сохранивших жизнеспособность после стерилизации раствором хлорида ртути. Использование аскорбиновой кислоты в концентрации равной 0,75 мМ, (135 мг/л) позволило увеличить число побегов, развивающихся на исходных эксплантах в среднем на 29,11% у сорта Вольница и на 67,14% у сорта Беглянка.

Применение глутатиона восстановленного в концентрации 0,25-0,5 мМ (65 -130 мг/л) позволило повысить жизнеспособность эксплантов малины сорта Вольница в среднем на 9,24%, а эксплантов сорта Беглянка – на 45,72%.

Применение аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона на этапе введения в культуру in vitro дает тенденцию к незначительному повышению коэффициентов размножения на этапе мультипликации у сорта Вольница. В отношении испытывающих сильное повреждение при стерилизации 0,1%-м раствором сулемы эксплантов малины сорта Беглянка применение глутатиона восстановленного оказалось эффективным, удалось повысить коэффициент размножения на среде для мультипликации на 30,43% по сравнению с контролем (Р< 0,05).

Внесение рутина в питательную среду для стимуляции морфогенеза неэффективно.

Увеличение содержания глутатиона до 0,75 мМ и 1 мМ не привело ни к увеличению количества жизнеспособных эксплантов, ни к росту коэффициентов размножения по сравнению с оптимальными вариантами, хотя названные показатели имели значения выше, чем в контроле.

Применение рутина ни в одной из испытанных концентраций не продемонстрировало положительных результатов. Во всех вариантах опыта и процент жизнеспособных эксплантов, и коэффициент размножения в первом субкультивировании на среде мультипликации у обоих сортов статистически не отличались от названных показателей в контроле.