Влияние азитромицина на генотоксичность в Allium тесте

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.18-049.8:575.224                         

В настоящее время при лечении нетяжелых инфекций одним из наиболее востребованных классов антибиотиков являются макролиды. Эти препараты, согласно отчетам Европейского общества антимикробной химиотерапии ( ESAC ), занимают 2-е место по объему потребления среди антибиотиков, применяющихся в амбулаторной практике, уступая только пенициллинам [1].

Представителем новой фармакологической группы макролидных антибиотиков — азалидов, является азитромицин. Препарат разработан фармацевтической компанией Pliva (Хорватия) и представлен под торговым названием сумамед [2].

Азитромицин является полусинтетическим антибиотиком, несколько отличающихся по структуре от классических макролидов. Обладает широким спектром антибактериального (бактериостатического) действия. Связываясь с 50S-субъединицей рибосом, угнетает пептидтранслоказу на стадии трансляции, подавляет синтез белка, замедляет рост и размножение бактерий, в высоких концентрациях оказывает бактерицидный эффект [3].

Азитромицин, благодаря своей уникальной фармакокинетике, которая выгодно отличает его от многих других антибиотиков, способен создавать максимальные и длительные концентрации в очаге поражения [1]. Азитромицина дигидрат — вещество пролонгированного действия, причем однократное применение средства, особенно в ударной дозе, сохраняет свое присутствие в организме до 6 дней . Характеризуется разнообразным фармакотерапевтическим применением, особенно при лечении бактериальных, респираторных, мочеполовых и энтерических инфекций [4].

Кроме антибактериального действия макролиды обладают умеренной противовоспалительной, иммуномодулирующей, мукорегулирующей и прокинетической активностью [2]. Использовался также при лечении COVID-19 [4]. Макролиды обладают высокой эффективностью и в то же время считаются одной из наиболее безопасных групп

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 9. №3. 2023 антибактериальных препаратов. Они не оказывают токсического влияния на органы и ткани макроорганизма [6] и реже, по сравнению с другими антибиотиками, вызывают аллергические реакции [1].

В то же время в литературе отсутствуют данные о влиянии азитромицина на клеточном уровне. В эксперименте в качестве модельного объекта был выбран лук обыкновенный ( Allium cepa L.) [6]. Широкое распространение тесты с A. cepa получили из-за того, что они являются более чувствительными и простыми по сравнению с биотестами животных [8, 9]. Несмотря на большие различия в организации и метаболизме между растительными и животными клетками, многими авторами сделан вывод о возможности экстраполировать полученные результаты A. cepa на животные организмы, включая человека [6, 7, 9]. При этом в настоящее время клетки лука используются для тестирования антибактериальных препаратов [10].

Цель исследования : тестирование азитромицина на выявление повреждений генетического аппарата в Allium тесте.

Материал и методы исследований

Луковицы, необходимые для постановки опыта, были приобретены в специализированном магазине, сорт лука обыкновенного Штутгартер. Постановку Allium -теста выполняли согласно [11]. Тестировали азитромицин (в виде азитромицина дигидрата) (РУП «Белмедпрепараты», Беларусь). Концентрации в мг/л указаны на Рисунке 1.

□ ПМ с учетом профазы          □ ПМ без учета профазы

Рисунок 1. Влияние азитромицина на патологию митоза. Варианты опыта: 1 — контроль (вода дистиллированная); 2 — азитромицин, 50 мг/л; 3 — азитромицин, 100 мг/л; 4 — азитромицин, 300 мг/л; 5 — восстановительный период после варианта №4; 6 — азитромицин, 500 мг/л; 7 — восстановительный период после варианта №6; 8 — азитромицин, 1000 мг/л; 9 — восстановительный период после варианта №8

Возможность ингибирующего либо стимулирующего эффектов тестируемых концентраций азитромицина оценивали с использованием метафазного и ана-телофазного метода учета перестроек хромосом в клетках корневых меристем лука. Патологию митоза (ПМ) подсчитывали как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток [12] и классифицировали отдельно для каждого корешка по И. А. Алову с незначительной модификацией [13]. Просмотр препаратов осуществляли на компьютеризированной кариологической станции, оснащенной световым микроскопом

(Olympus BX-40-увеличение-400×). По каждому варианту было просмотрено не менее 10 000 клеток.

Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили на с помощью пакета прикладного программного обеспечения “Statsoft (USA) Statistica v.7.0”. с расчетом выборочной средней и стандартной ошибки среднего. Для данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали дисперсионный анализ (ANOVA) и t-критерий Стьюдента для попарных сравнений. Нулевую гипотезу отклоняли при уровне статистической значимости p <0,05 [14].

Результаты исследований и их обсуждение

Патологический митоз — один из способов возникновения мутаций и развития анеуплоидии [13]. Однако воздействие небольших доз обратимо для большинства форм патологий митоза, поскольку в течение нескольких часов через ряд механизмов с участием белков может восстановиться митотический аппарат и продолжиться митотическое деление [13]. С патологией митоза у человека связано развитие ряда заболеваний. Патологические митозы часто возникают при канцерогенезе, лучевой болезни и вирусной инфекции. Патология митоза может носить функциональный и органический характер. Функциональные нарушения деления клеток могут выражаться, например, в гипореактивности вступающих в митоз клеток .

В текущем эксперименте в контроле значение ПМ с учетом профазы составило 6,6%, что незначительно превышает нормальное значение уровня спонтанного мутирования: 2–5% [15]. Результаты анализа показали, что все тестируемые концентрации азитромицина в первом митозе не вызывают существенное повышение значений ПМ.

Однако для концентрации 300,0 мг/л азитромицина было отмечено, что в варианте «последействие, спустя 48 часов» (Рисунок 1: вариант 5), значение ПМ по сравнению с контрольной цифрой возросло существенно в 4,9 раза. Также если сравнивать варианты 4 и 5: когда фиксировали процесс деления клеток в первом митозе после действия антибиотика и вариант его последействия, то в этом случае установлено возрастание значения ПМ в 8,0 раз (Рисунок 1): с 4,1% до 32,3%. В то время как для более высоких концентраций антибиотика, равных 500,0 и 1000,0 мг/л, подобной картины не наблюдали. Следует напомнить, что азитромицина дигидрат — вещество пролонгированного действия [3]. Поэтому, чтобы корректно оценивать возможные патологические процессы в делящихся клетках образовательной ткани под влиянием разных концентраций тестируемого антибиотика: от 50,0 до 1000,0 мг/л, необходимо проанализировать состав и спектр патологий митоза, а также определить, каков характер повреждения в клетке каждая из концентраций вызывает.

В контрольном варианте из всех регистрируемых патологий митоза наблюдали в 68% патологию «забегание/отставание хромосом» и в 24% — патологию «асинхронное веретено деления» (Рисунок 2). Также в единичных клетках, что составляет 0,1–0,4%, отмечены рассеивание хромосом в анафазе, выброс хромосом, фрагменты. Мы акцентируем внимание на наличие микроядер в клетках контрольного варианта (Рисунок 3: 1б), подчеркивая, что такой признак рассматривается как морфологический пассивный маркер генетической нестабильности [16]. В то же время следует помнить, что, согласно [17], сами микроядра также могут являться источником возникновения дополнительной генетической нестабильности. В итоге все это приводит к появлению разнообразных повреждений ДНК и их множественному накоплению. Патология митоза «забегание/отставание хромосом» в метакинезе и при расхождении к полюсам возникает при повреждении хромосом в области кинетохора [18].

Однако снижение функциональной активности кинетохора может возникать не только в патологических, но и физиологических условиях [13].

Асинхронное веретено деления (экваториальное разделение хромосом в анафазе) вызвано аномальной ориентацией хромосом от полюса к полюсу в метафазе, является острым аберрантным состоянием, которое возникает в результате нерегулярных путей сборки веретена деления и его аномальной активности [19]. Данная патология напрямую не связана с клеточным циклом и собственно митозом. Встречается и в физиологически оптимальных условиях роста. Сигнальные механизмы, определяющие расположение группы хромосом (среднюю плоскость), особенно в асимметрично делящихся клетках, которые имеют решающее значение для определения судьбы клеток и дальнейшей дифференцировки тканей, остаются невыясненными [20].

Влияние азитромицина на типы патологий митоза представлено на Рисунке 2. Следует отметить, что при действии всех концентраций азитромицина: от 50,0 до 1000,0 мг/л наблюдается такая же тенденция как в контрольном варианте по сохранению спектра патологий митоза и по доминированию, во-первых, патологии «забегание/отставание хромосом», и во-вторых, патологии «асинхронное веретено деления» (Рисунок 3: 7а). Процент упомянутых патологий митоза колеблется, соответственно, от 52 до 74, и от 7 до 22 (Рисунок 2).

□ Ас Вер □ з/отст хр □ выбр хр □ мосты □ рассеив □ фрагмент □ слипание □ к-митоз □ разное

Рисунок 2. Влияние азитромицина на состав и спектр патологий митоза. Обозначения вариантов — те же, что для Рисунка 1

По своей встречаемости в опытных вариантах в меньшей степени определяемые патологии митоза располагаются в следующей последовательности: к-митоз (Рисунок 3: 2а, 3б, 6б, 7б), рассеивание хромосом (Рисунок 3: 2а, 3б, 4б, 6б, 7б), выбросы хромосом (Рисунок 3: 5а, 8б), полиплоидность (Рисунок 3: 2а, 6б, 7б), липкость хромосом (Рисунок 3: 5а, 8а), хромосомные и хроматидные мосты (Рисунок 3: 8а), пикноз интерфазных ядер (Рисунок 3: 1а, 4а, 4б, 6б, 7а, 8г). и вызваны дисфункцией ядерного веретена деления. Рассмотрение характеристик упомянутых патологий митоза подтверждает наше предположение.

а

1 — азитромицин, 50 мг/л: а — микроядра на стадии телофазы + пикноз; б — ядерные почки

*•*•

б

2 — азитромицин, 100 мг/л: а — митоз, ядра в норме; б — хромосомы в норме + большое ядро + слипание хромосом

а

б

•Ш^ ' * , ^

Ч #

4 — восстановительный период после варианта №3: а — пикноз; б — ядра в норме и пикноз ядер

б

5 — азитромицин, 500 мг/л: а — выброс хромосомы в анафазе + вздутие хромосом; б — ядра в норме + забегание хромосом

6 — восстановительный период после варианта №5: а — асинхронное веретено деления + большое ядро; б — полиплоидная клетка + ядерная почка

а

б

7 — азитромицин, 1000 мг/л: а — ядра в норме + пикноз; б — полиплоидная клетка

H

а

в

б

8 — восстановительный период после варианта №7: а — мосты хроматидные; б — выбросы хромосомы за веретено деления; в — ядерные почки + большое ядро; г — пикноз ядер

Рисунок 3. Влияние азитромицина на типы патологий митоза

К-митоз указывает на то, что многие химические вещества ингибируют образование веретена в соответствии с механизмом, сходным с действием колхицина, и индукция к-митоза обычно ассоциируется с ядами веретена, что указывает на анеугенный эффект [21]. Исход к-митоза зависит от дозы и времени воздействия статмокинетического яда на делящуюся клетку. При токсических дозах наблюдается пикноз ядра и гибель клетки. Воздействие небольших доз обратимо. В течение нескольких часов может восстановиться митотический аппарат и продолжиться митотическое деление [13]. Согласно [22], присутствие к-метафаз в клетках образовательной ткани может привести к изменению плоидности, в частности к

полиплоидизации, хотя наиболее частым результатом является индукция микроядер в результате фрагментации или отставания хромосом [13]. Полиплоидия отнесена к ингибированию полного нарушения веретенообразного механизма [19].

Рассеивание хромосом как на стадии метафазы, так и на стадии анафазы происходит в результате повреждения или полной дезорганизации митотического аппарата. Эту патологию митоза рассматривают как одно из проявлений к-митоза. Образование отстающих хромосом также обусловлено ингибированием полимеризации тубулина или белков цитоскелета [23].

В текущем эксперименте при действии азитромицина, начиная с концентрации 100,0 мг/л до 1000,0 мг/л, в делящихся клетках напрямую наблюдали полиплоидные клетки, которые содержали тетраплоидный набор хромосом (Рисунок 3: 2а, 6б, 7б). Неоднократно отмечали существенное увеличение размеров ядер интерфазных клеток (Рисунок 3: 2б, 6а, 8в) и это является свидетельством проявлением механизма адаптации и служит дополнительным защитным фактором [24]. Гигантские клетки могут быть полиплоидными клетками, которые произошли посредством эндорепликации или эндомитоза, что можно рассматривать как крайний случай онтогенетической амплификации генов [24].

Следует дополнить, что в единичных интерфазных клетках уже при действии 50,0 мг/л азитромицина отмечали наличие ядерных почек (рисунок е почки рассматриваются как маркеры полиплоидизации и амплификация генов, и их формирование приводит к изгнанию лишнего генетического материала из анеуплоидных клеток [25].

Хромосомная липкость отражает высокотоксичные эффекты на хроматин, обычно необратимого типа (представляет собой нерепарируемый эффект), которые могут привести к гибели клеток [26].

Пикноз ядерного аппарата, наблюдаемый в интерфазных клетках в единичных случаях при минимальной тестируемой концентрации азитромицина (50,0 мг/л), и в 100 % клетках, но только отдельных единичных корней, начиная с концентрации 300,0 мг/л (Рисунок 2, Рисунок 3: 1а, 4а, 7а, 8г), свидетельствует о смерти клеток, что приводит к некрозу тканей [27].

При микроскопическом исследовании были выявлены единичные клетки с сильно выраженным плазмолизом, также в зоне дифференциации многие клетки корешков лука имели плотную конденсированную цитоплазму. Такая морфологическая картина типична для процесса программируемой клеточной гибели у растений при действии ксенобиотиков.

Заключение

Результаты анализа показали, что все тестируемые концентрации азитромицина (50,0– 1000,0 мг/л) в первом митозе не вызывают существенное повышение значений патологии митоза (ПМ) по сравнению с негативным контролем. Однако отмечено существенное возрастание (в 8 раз) числа клеток с ПМ в варианте «последействие, спустя 48 часов» для концентрации 300,0 мг/л азитромицина: с 4,1% до 32,3%. В то время как для более высоких концентраций антибиотика, равных 500,0 и 1000,0 мг/л, подобной картины не наблюдали.

Следует отметить, что при действии всех тестируемых концентраций азитромицина наблюдается такая же тенденция как в контрольном варианте по сохранению спектра ПМ и по доминированию, соответственно, во-первых, патологии «забегание/отставание хромосом», и во-вторых, патологии «асинхронное веретено деления». Процент упомянутых ПМ колеблется, соответственно, от 52 до 74, и от 7 до 22.

По своей встречаемости в опытных вариантах иные типы ПМ располагаются в следующей последовательности: к-митоз, рассеивание хромосом, выбросы хромосом, полиплоидность, липкость хромосом, хромосомные и хроматидные мосты, пикноз интерфазных ядер.

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 9. №3. 2023

Восстановительный период (спустя 48 часов после действия антибиотика) для азитромицина не снижает количество клеток с ПМ, но изменяет их состав и спектр.