Влияние бессимптомного и легкого течения COVID-19 на характеристики спермы

The article can be used under the CC BY-NC-ND 4 license

Submitted 26.06.2022

Revised 16.08.2022

Published 13.09.2022

ОБОСНОВАНИЕ

Пандемия новой коронавирусной инфекции (COVID-19)1 стала настоящим вызовом для всего здравоохранения в целом и репродуктивной медицины в частности. На фоне пандемии наблюдается значительная естественная убыль населения России. Сложная демографическая ситуация усугубляется снижением числа родившихся в России во время пандемии детей по сравнению аналогичным периодом до пандемии.

Как в России, так и во всем мире предпринимаются попытки оценить потенциальные риски и последствия влияния новой коронавирусной инфекции на мужскую репродуктивную систему, в частности на параметры спермы [1–3]. Однако изучение влияния на мужскую репродуктивную систему проводится преимущественно у пациентов с коронавирусной инфекцией средней и тяжелой формы течения [4, 5]. Между тем наибольшее распространение (более 80%) получили легкие и бессимптомные формы течения инфекции. Большинство мужчин репродуктивного возраста переносят новую коронавирусную инфекцию именно в таких формах, поэтому, на наш взгляд, легкие и бессимптомные формы течения COVID-19 требуют самой пристальной оценки возможного влияния на морфофункциональные характеристики сперматозоидов и биохимические параметры спермы.

Цель исследования — изучение влияния COVID-19 легкого и бессимптомного течения на параметры спермы мужчин.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Многоцентровое наблюдательное когортное проспективное.

Критерии соответствия

Критерии включения: мужской пол, отсутствие антител (IgM и IgG) к вирусу SARS-CoV-2, отсутствие COVID-19 и вакцинации против COVID-19 в анамнезе.

Критерии невключения: пациенты, которые перенесли новую коронавирусную инфекцию или были вакцинированы от COVID-19 до первого обследования и/или имели в сыворотке крови анти- тела к SARS-CoV-2; пациенты, которые перенесли COVID-19 бессимптомно, но не имели определяемого уровня антител.

Критерии исключения: получение в период между первым и повторным обследованием андроло-гического лечения, и/или средняя и тяжелая формы течения COVID-19, и/или лечение препаратами, способными оказывать негативное воздействие на мужскую фертильность [4, 6], в том числе в связи с новой коронавирусной инфекцией, и/или участие в вакцинации.

Условия проведения

Исследование выполнено на базах ГБУЗ АО «Центр охраны здоровья семьи и репродукции», ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», ГБУЗ АО «Городская клиническая больница № 3 имени С.М. Кирова» и лаборатории «Диамед-экспресс» ООО «РЕПРОДИАМЕД» г. Астрахани.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось с мая 2020 г. по февраль 2022 г., двукратно с интервалом 3–5 мес.

Описание медицинского вмешательства

Для достижения поставленной цели пациентам, обратившимся для проведения спермограммы, выполнены комплексный анализ спермы и определение в сыворотке крови антител (IgM и IgG) к SARS-CoV-2 (COVID-19).

Комплексный анализ спермы, кроме выполнения стандартной спермограммы по протоколу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [7], включал MAR-тест (тест Mixed agglutination reaction выявляет в эякуляте антиспермальные антитела — иммуноглобулины изотипов G, A, M), определение в спермоплазме цинка, лимонной кислоты, фруктозы, активности нейтральной α -глюкозидазы и акрозина, степени фрагментации ДНК-сперматозоидов, взаимодействия сперматозоидов с гиалуроновой кислотой.

Для выполнения MAR-теста использовали коммерческие наборы SpermMar IgA и SpermMar IgG (FertiPro, Бельгия), а также ImmunoSpheres Anti-IgM (Bioscreen Inc., США). Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями руководства ВОЗ [7].

Определение уровня цинка в спермоплазме проводили спектрофотометрическим методом в соответствии с рекомендациями руководства ВОЗ [7].

кт ГА

Определение в спермоплазме уровня лимонной кислоты проводили спектрофотометрическим методом с использованием коммерческого набора Citric Acid Test (FertiPro, Бельгия). Оптическую плотность определяли при длине волны 405 нм.

Для определения в спермоплазме уровня фруктозы использовали спектрофотометрический метод [7]. В работе применяли коммерческий набор Fructose Test (FertiPro, Бельгия). Оптическую плотность определяли при длине волны 492 нм.

Активность нейтральной α -глюкозидазы определяли спектрофотометрическим методом [8] с р-нитрофенил- α -D-глюкопиранозидом в качестве субстрата. Для исследования использовали коммерческий набор EpiScreen Plus (FertiPro, Бельгия). Оптическую плотность определяли при длине волны 405 нм.

Для определения степени фрагментации ДНК сперматозоидов оценивали дисперсию хроматина [8]. В работе использовали коммерческий набор GoldCyto DNA (Guangzhou Jinsaite Trading, Китай).

Тест НВА (hyaluron binding assay) на связывание сперматозоидов с гиалуроновой кислотой проводили на слайдах с иммобилизованной гиалуроновой кислотой по стандартной методике [9, 10] с использованием коммерческого набора HBA Assay (Biocoat Inc., США).

Активность акрозина определяли стандартным спектрофотометрическим методом с N- α -бензоил-DL-аргинин-p-нитроанидидом (BAPNA) в качестве субстрата [11] при помощи коммерческого набора AcroScreen (Bioscreen Inc., США). Оптическую плотность определяли при длине волны 405 нм.

Определение антител (IgM и IgG) к SARS-CoV-2 (COVID-19) в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Россия) и SARS-CoV-2 IgM Screen (ИМБИАН, Россия).

Этическая экспертиза

Работа выполнена в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками от 2013 года. От всех обследованных лиц получено информированное согласие на проведение исследования и использование анонимизированных данных о состоянии их здоровья в научных целях.

Статистический анализ

Исходя из поставленной цели, для статистического анализа использовали t-критерий Стьюдента для связанных выборок (парный критерий Стьюдента), программный пакет MedCalc Ver.19.7 (MedCalc Software Ltd., Бельгия). В качестве порогового уровня статистической значимости принято значение p <0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

Всего обследовано 397 пациентов в возрасте от 18 до 55 (средний возраст 32,86±6,16) лет. У всех обследованных в сыворотке крови отсутствовали антитела (IgM и IgG) к вирусу SARS-CoV-2 (COVID-19). По результатам первого обследования с использованием критериев ВОЗ нормозооспермия установлена у 33,5% ( n =133) пациентов, патоспермия — у 66,5% ( n =264) [7].

Следующее обследование проведено с той же группой пациентов спустя 3–5 мес.

Основные результаты исследования

За период наблюдения 36,27% пациентов ( n =144, от 19 до 55 лет, средний возраст 33,19±6,02 года) перенесли новую коронавирусную инфекцию (при обследовании в сыворотке крови обнаружены антитела IgG к SARS-CoV-2), из них бессимптомное течение заболевания имели 81,25% ( n =117, от 19 до 55 лет, средний возраст 33,11±5,83 года), легкое течение — 15,28% ( n =22, от 23 до 47 лет, средний возраст 32,50±5,68 года), средней степени тяжести или тяжелое течение болезни (в том числе потребовавшее госпитализации) — 3,47% ( n =5, от 30 до 55 лет, средний возраст 38,00±10,15 года). Остальные 63,73% пациентов ( n =253, от 18 до 55 лет, средний возраст 32,68±6,32 года) за период наблюдения не болели новой коронавирусной инфекцией (при обследовании в сыворотке крови антитела IgG и/или IgM к SARS-CoV-2 не обнаружены).

Согласно критериям соответствия, из дальнейшего исследования были исключены 173 пациента, данные которых в дальнейшем не учитывались.

Из оставшихся 224 пациентов, не получавших какого-либо лечения, не болели новой коронави- русной инфекцией 58,48% (группа 1, n=131, от 19 до 53 лет, средний возраст 32,82±6,12 года), перенесли коронавирусную инфекцию бессимптомно 34,82% (группа 2, n=78, от 19 до 52 лет, средний возраст 32,52±5,83 года), в легкой форме — 6,70% (группа 3, n=15, от 25 до 39 лет, средний возраст 33,06±4,45 года).

Данные стандартной спермограммы в начале обследования сопоставили и попарно проанализировали при помощи t-критерия Стьюдента для связанных выборок с повторной спермограммой, выполненной через 3–5 мес.

В группе 1 при числе наблюдаемых 131 число степеней свободы (f) было равно 130, а критическое значение t-критерия Стьюдента (t_кр) составило 1,980. Анализ показал, что для всех параметров (t_наб) стандартной спермограммы выполнялось условие t_набкр, следовательно, изменения признаков были статистически незначимы. Аналогично статистически значимых изменений не наблюдалось и для других оцениваемых параметров (MAR-тест, уровень цинка, уровень лимонной кислоты, уровень фруктозы, активность нейтральной α -глюкозидазы, степень фрагментации ДНК сперматозоидов, взаимодействие сперматозоидов с гиалуроновой кислотой и активность акрозина).

В группе 2 при числе наблюдаемых 78 число степеней свободы (f) было равно 77, а критическое значение t-критерия Стьюдента (tкр) составило 1,992. Анализ показал, что для всех параметров (tнаб) стандартной спермограммы выполнялось условие tнабtкр, следовательно, изменения признака были статистически значимы (p=0,001).

В группе 3 при числе наблюдаемых 15 число степеней свободы (f) было равно 14, а критическое значение t-критерия Стьюдента (t_кр) составило 2,145. Анализ показал, что для всех параметров (t_наб) стандартной спермограммы выполнялось условие t_набкр, т.е. изменения признаков были статистически незначимы. Аналогично статистически значимых изменений не наблюдалось для остальных оцениваемых параметров (MAR-тест, уровень цинка, уровень лимонной кислоты, уровень фруктозы, активность нейтральной α -глюкозидазы, степень фрагментации ДНК сперматозоидов и активность акрозина), за исключением HBA-теста, для которого парный t-критерий Стьюдента (t_наб) составил 3,270, т.е. t_наб>t_кр, следовательно, изменения признака были статистически значимы ( p =0,0016).

Дальнейший анализ показал, что результаты взаимодействия сперматозоидов с гиалуроновой кислотой в пределах нормативных значений (HBA-тест ≥ 80%) и ниже нормативных значений (HBA-тест <80%) были очень близкими во всех трех группах пациентов при первом обследовании (табл. 1). При повторном обследовании оказалось, что в группе 1 соотношение пациентов с результатами HBA-теста в пределах нормативных и ниже нормативных значений не изменилось в отличие от групп 2 и 3, в которых соотношение изменилось в сторону увеличения результатов HBA-теста ниже нормативного значения (см. табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние новой коронавирусной инфекции на репродуктивную систему мужчин в настоящее время активно изучается [5, 12]. Предварительные

Таблица 1 / Table 1

Оценка взаимодействия сперматозоидов с гиалуроновой кислотой (HBA-тест) / Evaluation of the interaction of spermatozoa with hyaluronic acid (HBA test)

Группы	Результаты HBA-теста				Изменение относительно первого обследования
	Первое обследование		Повторное обследование
	≥ 80%*	<80%	≥ 80%*	<80%	≥ 80%*	<80%
Группа 1, n =131	93,13 ( n =122)	6,87 ( n =9)	93,13 ( n =122)	6,87 ( n =9)	0	0
Группа 2, n =78	93,59 ( n =73)	6,41 ( n =5)	87,18 ( n =68)	12,82 ( n =10)	1	t
Группа 3, n =15	93,33 ( n =14)	6,67 ( n =1)	80,0 ( n =12)	20,0 ( n =3)	1	t

Примечание . * Соответствует нормативному значению.

Note: * Corresponds to the standard value.

кт ГА

исследования свидетельствуют о несомненном прямом или косвенном влиянии новой коронавирусной инфекции на репродуктивное здоровье мужчин [4, 13]. При среднем и тяжелом течении коронавирусной инфекции невозможно исключить влияние таких факторов, как гипертермия, «цито-киновый шторм», системное снижение оксигенации и токсическое влияние лекарственных препаратов [5, 6]. В этом случае исследование легких и бессимптомных форм течения COVID-19 поможет выявить возможное прямое влияние SARS-CoV-2 на сперматогенез, морфофункциональное состояние сперматозоидов и их биохимическое окружение.

Полученные нами данные свидетельствуют, что при наиболее распространенных (бессимптомное и легкое) формах течения новой корнавирусной инфекции параметры стандартной спермограммы достоверно не изменяются. Не наблюдается достоверного влияния на показатели MAR-теста, уровни лимонной кислоты, цинка и фруктозы в эякуляте, активность нейтральной α -глюкозидазы и акрозина. Отсутствовало, по нашим данным, достоверное влияние на степень фрагментации ДНК сперматозоидов. Вероятно, повреждение ДНК сперматозоидов, которое наблюдалось другими авторами [4, 14] при средних и тяжелых формах течения COVID-19, было связано с оксидативным стрессом [15–17] и/или токсическим воздействием лекарственных препаратов [6], но не с прямым влиянием патогена.

Из всех оцениваемых параметров новая коронавирусная инфекция (перенесенная в легкой и бессимптомной форме) в ряде случаев оказывала достоверное отрицательное влияние только на взаимодействие сперматозоидов с гиалуроновой кислотой. Поскольку другие возможные факторы влияния были максимально исключены, мы полагаем, что в этом случае речь может идти о непосредственном, возможно, специфическом влиянии SARS-CoV-2, т.е. при COVID-19 существует риск нарушения процесса взаимодействия специфических рецепторов сперматозоидов, ответственных за связывание с гиалуроновой кислотой, zona pellucida , и, соответственно, негативное влияние на процесс оплодотворения.

Нам представляется по меньшей мере три вероятных причины, которые могут оказать влияние на результаты HBA-теста: (1) снижение количества специфических рецепторов, презентованных на поверхности сперматозоидов; (2) изменение пространственной конфигурации специфических рецепторов; (3) блокирование специфических рецеп- торов. Остается неясным и требует дальнейшего изучения, какой именно механизм приводит к нарушению взаимодействия сперматозоидов с гиалуроновой кислотой.

Ограничения исследования

Выборка сформирована преимущественно из мужчин, обращавшихся к урологам-андрологам из-за отсутствия беременности у их партнерш на протяжении от 4 до 12 мес регулярной половой жизни без использования средств контрацепции. Небольшое количество пациентов (менее 5%) в представленной выборке проходили обследование в процессе подготовки к планируемой беременности. Таким образом, большая часть пациентов, включенных в исследование, могла иметь нарушения репродуктивной функции в виде субфертильности или инфертильности еще до заболевания COVID-19.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Легкое и бессимптомное течение COVID-19 не оказывает влияния на параметры стандартной спермограммы, степень фрагментации ДНК сперматозоидов, показатели MAR-теста, уровни лимонной кислоты, цинка и фруктозы в эякуляте, на активность нейтральной α -глюкозидазы и акрозина. В то же время легкое и бессимптомное течение COVID-19 может приводить к нарушению взаимодействия сперматозоидов с гиалуроновой кислотой. Пациентам, перенесшим COVID-19, при выполнении спермограммы может быть дополнительно рекомендовано проведение HBA-теста, особенно если предполагается их участие в программах с использованием вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов. Молекулярные механизмы влияния SARS-CoV-2 на взаимодействие сперматозоидов с гиалуроновой кислотой требуют дополнительного исследования.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Д.Л. Луцкий — концепция и дизайн исследования, статистический анализ данных, написание рукописи; Р.М. Махмудов — концепция и дизайн исследования, статистический анализ данных; А.М. Луцкая — сбор и обработка материала, написание рукописи; С.В. Выборнов, Е.С. Калашников, В.В. Лозовский, В.Вл. Лозовский, Л.М. Шишкина — сбор и обработка материала; Д.М. Никулина, А.А. Николаев — редактирование рукописи. Авторы подтверждают соответствие своего ав- эактика торства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Author contribution. D.L. Lutsky — research concept and design, statistical data analysis, manuscript writing; R.M. Makhmudov — research concept and design, statistical data analysis; A.M. Lutskaya — collection and processing of material, manuscript writing; S.V. Vybornov, E.S. Kalashnikov, V.V. Lozovskii, V.Vl. Lozovskiy, L.M. Shishkina — collection and processing of the date; D.M. Nikulina, A.A. Nikolaev — manuscript editing. The authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

Funding source. The study had no sponsorship.