Влияние биологически активных веществ тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) на рост дрожжевых клеток

В настоящее время население пожилого возраста увеличивается во всем мире. Прогнозируют, что людей с возрастом старше 60 лет станет около двух миллиардов к 2050 году. Несмотря на то, что количество людей в пожилом возрасте растет, сам процесс старения описывают как постепенную утрату физиологического контроля, при котором происходят различные нарушения в организме: появление мутаций в геноме, дисфункции теломер, повреждение белковых молекул, митохондриальная дисфункция, клеточное старение. В результате этого возникает риск различных заболеваний, среди которых сердечно-сосудистые и нейро-дегенеративные, а также рак [1].

Изменять клеточные процессы, а также повреждать ДНК способны активные формы кислорода (АФК), которые накапливаются в процессе старения. К таким формам кислорода относят супероксид (О 2 -), пероксид водорода (Н 2 О 2 ), пероксильный радикал (ОН^–), перекиси липидов. Небольшое их количество способствует регулированию клеточной передаче сигналов. При различных сбоях в организме происходит их увеличение, которые негативно влияют на функции белка, изменяя цепи аминокислот [2]. Данный процесс, при котором антиоксидантная система организма не может подавить рост свободных избыточных радикалов, назвали окислительным стрессом.

Снижение окислительного стресса можно осуществлять с помощью антиоксидантов синтетического и природного происхождения, при этом использование синтетических антиоксидантов нежелательно, в связи с побочными эффектами. Среди экзогенных антиоксидантов самыми известными являются витамин С (аскорбиновая кислота), витамин Е, полифенолы, а также каротиноиды. Данные вещества содержатся в различных фруктах и овощах, крупах и других продуктах [3]. В последние годы традиционные лекарственные растения становятся популярными источниками биологически активных веществ (БАВ) с антиоксидантными свойствами. При этом из растений извлекают как индивидуальные вещества, так и комплексы (экстракты) [4].

Растительное сырье Сибирского федерального округа (СФО) является потенциальным источником антиоксидантных БАВ, которые могут помочь в борьбе с АФК. Так, лекарственное растение тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) содержит в себе ряд вторичных метаболитов, обладающих антиоксидантными свойствами. Тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) имеет широкое применение в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности. Лекарственное растение тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) содержит в себе: эфирное масло (примерно 0,6%), в состав которого входит тимол (до 42%), карвакрол, n-цимол, α-терпинеол, борнеол, гераниол [5]; дубильные вещества; горечи; камедь; тритерпеновые соединения – урсоловая и олеаноловая кислоты; флавоноиды – апигенин (2,770 мг/г), нарингенин (0,121 мг/г), цинарозид, космоссиин, скутеллярин; минеральные соли; пигменты – зеаксантин, лютеин, лютеолин (0,84 мг/г) [6]; сахара – глюкозу, галактозу, арабинозу, рамнозу, ксилозу, глюкуроновая кислота, галактуроновая кислота [7]; аминокислоты – цистин, аланин, лейцин; жирные кислоты – пальмитиновая, линолевая, линоленовая кислоты; органические кислоты – лимонная, яблочная, малоновая, щавелевая кислоты [8, 9]. Также экстракты на основе тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.) имеют галловую, гидроксибензойную, хлороге-новую, сиринговую, кумаровую, бензойную, коричную и розмариновую кислоту. Благодаря наличию данных веществ тимьян обыкновенный (Thymus vulgaris L.) обладает противовоспалительной, антимикробной, болеутоляющей и антиоксидантной активностью.

На сегодняшний день существуют экспериментальные модели, такие как нематоды ( Caenorhabditis elegans ), плодовые мухи ( Drosophila melanogaster ), дрожжи ( Saccharomyces cerevisiae ), короткоживущие рыбы ( Nothobranchius furzeri ) или грызуны (мыши и крысы), которые позволяют изучить влияние биологически активных веществ растительного происхождения на процесс старения [10]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются часто изучаемыми, при этом легко анализируемыми простейшими эукариотами, обеспечивающие понимание молекулярных путей, которые лежат в основе некоторых нейродегене-ративных расстройств человеческого организма, а также одной из наиболее широко используемых модельных систем для изучения процесса старения [11]. Из-за достаточно продолжительной человеческой жизни человека и неизвестных побочных эффектов потенциальных омолаживающих соединений, почкование дрожжей является полезной отправной точкой для исследования долголетия. Кроме того, S. cerevisiae имеет относительно короткую и легко измеримую продолжительность жизни [12].

Поскольку антивозрастные химические вещества воспринимаются как кратчайший путь к долгой и здоровой жизни, на протяжении десятилетий было выявлено и изучено бесчисленное множество соединений на предмет их потенциальных свойств. Главной целью настоящего исследования является изучение непосредственное влияние биологически активных соединений, полученных из биомассы каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L .), на рост дрожжевых клеток S. cerevisiae .

Материалы и методы

Объектом исследования служил высушенный экстракт каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L .). Биомассу каллусной культуры тимьяна обыкновенного выращивали в условиях in vitro на плотных питательных средах следующего минерального и гормонального состава: макросоли В5 × 20–50,00 мл; микросоли В5 – 10,00 мл; Fe-ЭДТА – 5,00 мл; тиамин – 10,00 мг; пиридоксин – 1,00 мг; никотиновая кислота – 1,00 мг; сахароза – 30,00 г.; инозит – 100,00 мг; кинетин – 2,00 мг; 6-бензи-ламинопурин – 0,10 мг; р-индолилуксусная кислота – 2,00 мг; 2,4 – дихлорфеноксиуксус-ная кислота – 2,00 мг; агар – 20,00 г.; дистиллированная вода – 1000 мл. Цикл выращивания каллусной культуры Thymus vulgaris L. составлял 4–5 недель.

Экстракт получали методом водноспиртовой экстракции при обработки измельчённой биомассы каллусной культуры Thymus vulgaris L. до 1 мм 70% этиловым спиртом в течение 4 ч при температуре 70 ℃, для экстракции использовали водяную баню (Еlmаsоniс S60Н, Германия) с восходящим холодильником в соотношение растительное сырье / экстрагент: 1:86. Высушивание экстракта осуществлялось на распылительной сушилке Mini 51 Spray Dryer B-290 (Buchi, Швейцария) при температурных режимах 60 ℃, 90 ℃ и 120 ℃, скорости потока воздуха (аспирации) 100 м³/ч и скорости подачи раствора в распылительную установку 7 мл/мин.

Рассматривали количественное содержание биологически активных соединений сухого водноспиртового экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного (Thymus vulgaris L.). Для этого применяли высоко-эффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Анализ проводили на жидкостном хроматографе (LC-20 Shimadzu Prominence, Япония). Использовалась хроматографическая колонка Kromasil 5 мкм С18, 250 • 4,6 мм; предколонка Security Guard Gartridge (С18) Phenomenex (США), объём инжекции 20 мкл. Температура колонки составляла 30 ℃ Режим элюирования изократический, ПФ состоит – АсСN: ИПС : Н2 O – Н3 РО4 (20:5:75 рН 3,5). Пробу готовили путем проведения гидролиза сухого экстракта в соляной кислоте (1,5 М). Для гидролиза сухого экстракта, высушенного при 60 ℃ брали 1,0 г, для 90 и 120 ℃ – 0,1 г. Гидролиз сухих экстрактов проводили на водяной бане в течение 1 ч, используя обратный холодильник. После рН гидролизатов доводили до нейтральной среды раствором гидроксида натрия.

Для оценки влияния биологически активных веществ сухого экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L .) на рост дрожжевых клеток применяли метод оценки прироста биомассы модельного организма Saccharomyces cerevisiae , используя показатели оптической плотности суспензионных культур [13]. В качестве модельного организма применяли штамм Saccharomyces cerevisiae Y-564. Штамм получен из ВКПМ ФГУП ГосНИИГе-нетика, Россия и предварительно выращен на питательной среде YEPD при температурном режиме 30 ℃ в течение 24 ч. Рост биомассы Saccharomyces cerevisiae Y-564 контролировали в кварцевых кюветах спектрофотометра UV 1800 (Shimadzu, Япония). Культивирование штамма дрожжей осуществлялось при температуре 30 ℃, оптической плотности 600 нм, в аэробных условиях с интервалом 1 ч, продолжительностью 72 ч и различной вариации концентрации экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L .) – 0,25 мг/мл, 0,50 мг/мл и 1,00 мг/мл. Доза внесения экстрактов каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris ) в суспензионную культуру дрожжей составляла 1%.

Результаты и обсуждения

Результаты изучения количественного и качественного состава биологически активных веществ в сухом экстракте каллусной культуры Thymus vulgaris L. при различной вариации температурного режима высушивания экстракта (60; 90 и 120 ℃), представлены на рисунках 1–3 и таблицах 1–3.

Рисунок 1. ВЭЖХ хроматограмма экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L., высушенного при 60 ℃: 4 – галловая кислота, 6 – апигенин-7-глюкозид, 8 – 3,4-диметоксибензойная кислота, 16 – кофейная кислота, 17 – хлорогеновая кислота, 24 – апигенин, 26 – тимол, 27 – карвакрол, 28 – кемпферол-d-глюкозид

Figure 1. HPLC chromatogram of Thymus vulgaris L. callus culture extract dried at 60 ℃: 4 – gallic acid, 6 – apigenin-7-glucoside, 8 – 3,4-dimethoxybenzoic acid, 16 – caffeic acid, 17 – chlorogenic acid, 24 – apigenin, 26 – thymol, 27 – carvacrol, 28 – kaempferol-d-glucoside

Таблица 1.

Компонентный состав экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. по данным ВЭЖХ (60 ℃)

мAU

0,0             2,5             5,0             7,5             10,0            12,5            15,0            17,5            20,0            22,5            25,0            27,5          мин

Table 1.

Component composition of Thymus vulgaris L. callus culture extract according to HPLC data (60 °C)

№ пика Peak number	Время удерживания, мин Holding time, min	Наименование компонента Name of the component	Количественное содержание, мг/г Quantitative content, mg/g
4	7,46	Галловая кислота | Gallic acid	0,546 ± 0,56
6	8,84	Апигенин-7-глюкозид | Apigenin 7 glucoside	4,064 ± 0,28
8	10,46	3,4-диметоксибензойная кислота | 3,4-dimethoxybenzoic acid	0,303 ± 0,12
16	14,96	Кофейная кислота | Caffeic acid	1,269 ± 0,89
17	16,27	Хлорогеновая кислота | Chlorogenic acid	0,222 ± 0,11
24	19,26	Апигенин | Apigenin	2,490 ± 0,39
26	20,31	Тимол | Thymol	0,221 ± 0,27
27	21,20	Карвакрол | Carvacrol	0,163 ± 0,23
28	21,59	Кемпферол-d-глюкозид | Kaempferol-d glucoside	0,146 ± 0,87

Рисунок 2. ВЭЖХ хроматограмма экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L., высушенного при 90 ℃: 1 – галловая кислота, 4 – апигенин-7-глюкозид, 6 – 3,4-диметоксибензойная кислота, 10 – кофейная кислота, 12 – хлорогеновая кислота, 21 – апигенин, 23 – тимол, 24 – карвакрол, 26 – кемпферол-d-глюкозид

Figure 2. HPLC chromatogram of Thymus vulgaris L. callus culture extract dried at 90 ℃: 1 – gallic acid, 4 – apigenin-7-glucoside, 6 – 3,4-dimethoxybenzoic acid, 10 – caffeic acid, 12 – chlorogenic acid, 21 – apigenin, 23 – thymol, 24 – carvacrol, 26 – kaempferol-d-glucoside

Таблица 2.

Компонентный состав экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. по данным ВЭЖХ (90 ℃)

Table 2.

Component composition of Thymus vulgaris L. callus culture extract according to HPLC data (90 °C)

№ пика Peak number	Время удерживания, мин Holding time, min	Компонент Component	Содержание, мг/г Content, mg/g
1	7,48	Галловая кислота | Gallic acid	0,759 ± 0,81
4	8,90	Апигенин-7-глюкозид | Apigenin 7 glucoside	9,058 ± 0,14
6	10,51	3,4-диметоксибензойная кислота | 3,4-dimethoxybenzoic acid	0,215 ± 0,29
10	14,97	Кофейная кислота | Caffeic acid	1,358 ± 0,58
12	16,28	Хлорогеновая кислота | Chlorogenic acid	0,278 ± 0,27
21	18,91	Апигенин | Apigenin	2,176 ± 0,02
23	19,62	Тимол | Thymol	0,043 ± 0,78
24	20,12	Карвакрол | Carvacrol	0,230 ± 0,93
26	21,10	Кемпферол-d-глюкозид | Kaempferol-d glucoside	0,450 ± 0,22

Рисунок 3. ВЭЖХ хроматограмма экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L., высушенного при 120 ℃: 1 – галловая кислота, 4 – апигенин-7-глюкозид, 5 – 3,4-диметоксибензойная кислота, 12 – кофейная кислота, 14 – хлорогеновая кислота, 20 – апигенин, 22 – кемпферол-d-глюкозид

Figure 3. HPLC chromatogram of Thymus vulgaris L. callus culture extract dried at 120 ℃: 1 – gallic acid, 4 – apigenin-7-glucoside, 5 – 3,4-dimethoxybenzoic acid, 12 – caffeic acid, 14 – chlorogenic acid, 20 – apigenin, 22 – kaempferol-d-glucoside

Исходя из проведенного хроматографического анализа видно, что максимальное количество биологически активных веществ сосредоточенно в экстракте Thymus vulgaris L ., высушенного при 60 и 90 ℃. Также хроматографический анализ показал наличие широкого содержания биологически активных веществ, которые могут способствовать росту биомассы дрожжей:

галловая, хлорогенновая и кофейная кислота и флавоноид – апегенин и его производные.

Результаты анализа влияния БАВ сухого экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. на рост дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae Y-564 при различных температурных параметрах распылительного высушивания (60; 90; 120 ℃) представлены на рисунках 4–6.

0,39

0,34

0,29

0,24

0,19

0,14

х+

I

II

—X- III

—+— К

Ахххххх

0,09

ХаХ

Таблица 3.

Компонентный состав экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. по данным ВЭЖХ (120 ℃)

Table 3.

Component composition of Thymus vulgaris L. callus culture extract according to HPLC data (120 °C)

№ пика Peak number	Время удерживания, мин Holding time, min	Компонент Component		Содержание, мг/г Content, mg/g
1	7,35	Галловая кислота | Gallic acid		0,125 ± 0,10
4	8,77	Апигенин-7-глюкозид | Apigenin 7 glucoside		11,505 ± 0,65
5	10,46	3,4-диметоксибензойная кислота | 3,4-dimethoxybenzoic acid		0,161 ± 0,07
12	14,95	Кофейная кислота | Caffeic acid		0,806 ± 0,27
14	16,32	Хлорогеновая кислота | Chlorogenic acid		0,053 ± 0,55
20	19,30	Апигенин	| Apigenin	1,183 ± 0,27
22	21,70	Кемпферол-d-глюкозид |	Kaempferol-d glucoside	0,107 ± 0,13

Продолжительность выращивания биомассы S. cerevisiae Y-564, ч

Duration of S. cerevisiae biomass cultivation Y-564, h

Рисунок 4. Изменение значения оптической плотности (OD) дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 во времени при разных значениях концентрации сухого экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L.), высушенного при 60 ℃: I – 0,25 мг/мл; II – 0,50 мг/мл; III – 1,00 мг/мл; К – контроль – 0,00 мг/мл

Figure 4. Change in the optical density (OD) of S. cerevisiae Y-564 yeast suspension over time at different concentrations of dry extract of callus culture of thyme (Thymus vulgaris L.) dried at 60 ℃: I – 0.25 mg/ml; II – 0.50 mg/ml; III – 1.00 mg/ml; K – control – 0.00 mg/ml

0,44

о ш о ч с

г

сб

0,29

0,24

У

S

с о

I

II

-X- III

-+- K

X

0,39

0,14

Q О

.^

й

0,19

Пн

О

"Wb

Х++'

±*х

10        15       20       25        30       35       40       45        50        55        60        65        70        75

Продолжительность выращивания биомассы S. cerevisiae Y-564, ч

Duration of S. cerevisiae biomass cultivation Y-564, h

хХххххххххххххххХх

0,09

Рисунок 5. Изменение значения оптической плотности (OD) дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 во времени при разных значениях концентрации сухого экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L.), высушенного при 90 ℃: I – 0,25 мг/мл; II – 0,50 мг/мл; III – 1,00 мг/мл; К – контроль – 0,00 мг/мл

Figure 5. Change in the optical density (OD) of S. cerevisiae Y-564 yeast suspension over time at different concentrations of dry extract of callus culture of thyme (Thymus vulgaris L.) dried at 90 ℃: I – 0.25 mg/ml; II – 0.50 mg/ml; III – 1.00 mg/ml; K – control – 0.00 mg/ml

0         5        10       15       20       25       30       35       40       45       50       55       60       65       70       75

Продолжительность выращивания биомассы S. cerevisiae Y-564, ч Duration of S. cerevisiae biomass cultivation Y-564, h

Рисунок 6. Изменение значения оптической плотности (OD) дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 во времени при разных значениях концентрации сухого экстракта каллусной культуры тимьяна обыкновенного ( Thymus vulgaris L .), высушенного при 120 ℃: I – 0,25 мг/мл; II – 0,50 мг/мл; III – 1,00 мг/мл; К – контроль – 0,00 мг/мл

Figure 6. Change in the optical density (OD) of S. cerevisiae Y-564 yeast suspension over time at different concentrations of dry extract of callus culture of thyme ( Thymus vulgaris L .) dried at 120 ℃: I – 0.25 mg/ml; II – 0.50 mg/ml; III – 1.00 mg/ml; K – control – 0.00 mg/ml

Результаты исследования, представленные на рисунке 4, говорят о том, что экстракт каллу-сной культуры Thymus vulgaris L. высушенный при температуре 60 ℃ с концентрацией 0,50 мг/мл имеет наивысшею активность, при такой концентрации биомасса дрожжевых клеток S. cerevisiae Y-564 имеет максимальную фазу роста в сравнении с контрольным образцом дрожжей. Концентрация 0,25 мг/мл экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. также стимулирует рост дрожжей, но в меньшей степени в сравнении с концентрацией 0,50 мг/мл. При концентрации в 1,00 мг/мл экстракта каллусной культуры

Thymus vulgaris L. происходило угнетение фазы роста дрожжей.

В результате проведенного анализа, представленного на рисунке 5, видно, что при различной вариации концентрации (0,25 мг/мл, 0,50 мг/мл и 1,00 мг/мл) экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L., высушенного при температуре 90 ℃, происходило стимулирование роста биомассы S. cerevisiae Y-564 . Максимальное стимулирование роста биомассы S. cerevisiae Y-564 наблюдалось при концентрации 0,50 мг/мл экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L.

Исходя из результатов исследования (рисунок 6) фактического стимулирования роста биомассы дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 экстрактом каллусной культуры Thymus vulgaris L ., высушенного при температуре 120 ℃, нет. Ни одна концентрация (0,25 мг/мл, 0,50 мг/мл и 1,00 мг/мл) экстракта не оказывала значительного влияния на рост модельного организма дрожжей. Но при некоторых режимах концентрирования (0,50 мг/мл и 1,00 мг/мл) на ограниченном временном промежутке (23–45 ч) наблюдалось значимое отличие роста дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 .

Заключение

Для применения сухого экстракта каллу-сной культуры Thymus vulgaris L. в качестве антивозрастной биологически активной добавки необходимо получить концентрат, который подвергался распылительному высушиванию при разных температурных параметрах (60; 90; 120 ℃). Каждый высушенный экстракт исследован на качественный и количественный состав биологически активных веществ. Так, в сухих экстрактах каллусной культуры Thymus vulgaris L ., присутствуют такие БАВ, как: галловая кислота, апигенин-7-глюкозид, 3,4-диметоксибензойная кислота, кофейная кислота, хлорогеновая кислота, апигенин, тимол, карвакрол, и кемпферол-d-глюкозид. В экстракте, высушенном при температуре 60 ℃ наблюдалось максимальное присутствие таких соединений как: апигенин-7-глюкозид (4,064 мг/г), апигенин (2,490 мг/г), кофейная кислота (1,269 мг/г), галловая кислота (0,546 мг/г), 3,4-диметоксибензойная кислота (0,303 мг/г) хлорогеновая кислота (0,222 мг/г). В экстракте, который высушен при 90 ℃ установлено следующее количественное содержание активных соединений: апигенин-7-глюкозид (9,058 мг/г), апигенин (2,176 мг/г), кофейная кислота (1,358 мг/г), галловая кислота (0,759 мг/г), хлорогеновая кислота (0,278 мг/г). При температурном режиме высушивания 120 ℃ экстракт отличался наименьшем содержанием биологически

активных соединений. В результате оптимальными температурными режимами распылительного высушивания экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. являются 60 и 90 ℃.

Также настоящие исследование подтвердило непосредственное влияние БАВ сухого экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L. на рост биомассы модельного штамма S. cerevisiae Y-564 . Наилучший результат влияния ростовых свойств биомассы дрожжевой суспензии S. cerevisiae Y-564 показал экстракт каллусной культуры Thymus vulgaris L., высушенный при температуре 90 ℃, с концентрацией 0,50 мг/мл. Именно при таких условиях наблюдался высокий прирост тест-культуры. Основываясь на данных результатах, биологическую активную добавку, содержащею 0,5 мг/мл экстракта каллусной культуры Thymus vulgaris L., можно использовать как ценный ресурс для выделения антивозраст-ного соединения (соединений).

Основываясь на полученных данных возможно предположить, что на рост дрожжевых клеток влияют такие БАВ, как галловая кислота, хлорогеновая кислота, кофейная кислота и флавоноид – апигенин и его производные.

Однако необходимы дальнейшие исследования на мышиных моделях с подробными исследованиями токсичности, для того чтобы в конечном итоге определить потенциал данного лекарственного растения в качестве антивоз-растного средства, которое способно замедлять процессы старения и продлевать продолжительность жизни.

Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «Скрининг биологически активных веществ растительного происхождения, обладающих геропротекторными свойствами, и разработка технологии получения нутрицевтиков, замедляющих старение» (проект FZSR-2020-0006).

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Инструментальные методы анализа в области прикладной биотехнологии» на базе КемГУ.