Влияние даларгина на активность Na, K-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии

N a, K-АТФаза является интегральным мембранным ферментом, использующим энергию гидролиза АТФ для транспорт ионов Na⁺ и K⁺ против электрохимического градиента. В клетках мозга градиенты ионов натрия и калия, создаваемые этим ферментом, необходимы для осуществления таких физиологических функций как регуляция объема, поддержание электрического потенциала, вторичный активный транспорт, а также обеспечение осмотического баланса в системе нейрон-экстраклеточный компартмент [5].

Нарушение снабжения кислородом тканей мозга, наступающее при ишемическом повреждении мозга, приводит к снижению активности Na, K-АТФазы [13]. В результате подавления ее активности нарушается транспорт ионов, развивается деполяризация мембраны, нейроны утрачивают свою важнейшую функцию — электрическую проводимость. Это может привести к чрезмерной секреции нейромедиаторов, перегрузке нейронов ионами кальция, и далее к вторичному ишемическому повреждению, т.е. активации фосфолипаз, липаз, протеаз, эндонуклеаз, неконтролируемого фосфорилирования, деградации мембран, и отёку мозга. Вместе с тем пока неясно как зависит степень ингибирования Na, K-АТФазы мозга от длительности ишемии и последующей реперфузии.

D-Ala2, Leu5, Агд6-энкефалин (даларгин) является синтетическим аналогом лей-энкефалина [3]. Этот пептид активирует р- и 6-рецепторы и проникает через гематоэнцефалический барьер только при его использовании в дозах не менее 0,5 мг/кг [9]. В экспериментах на животных с острой ишемией миокарда, вызванной окклюзией коронарной артерии, получены данные о благоприятном действии даларгина [7]. Даларгин оказывает противоишемическое действие при снижении перфузионного давления в системе кровоснабжения мозга при реконструктивных операциях на сонных и позвоночных артериях мозга [1]. Целью

данной работы было выяснение зависимости активности Na, K-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс от длительности ишемии и реперфузии, а также роли опиоидного нейропептида даларгина в защите фермента от ишемического повреждения.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 46 белых крысах-самцах Вистар, массой 200-230 г. Экспериментальную ишемию головного мозга вызывали окклюзией двух сонных артерий в течение 30, 60 и 90 мин. У части животных после 60-минутной окклюзии двух сонных артерий моделировали реперфузию путем снятия лигатуры. Продолжительность реперфузии составила 60 и 90 мин. У животных контрольной группы воспроизводилась наркотизация, кожный разрез и выделение артерий без последующей перевязки сосудов. Все хирургические процедуры проводили под наркозом (внутрибрюшное введение тиопентала натрия в дозе 40-50 мг/кг). В период ишемии и реперфузии температура тела животного поддерживали на нормальном уровне (37°С).

Фармакопейный препарат даларгин (НПО «Микроген») вводили внутрибрюшинно в дозе 0, 1 и 0, 5 мг/кг за 30 мин до наложения лигатуры на сонные артерии. Контрольным (ложноопери-рованным) животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.

После декапитации крыс для исследования использовалась кора больших полушарий головного мозга. Синаптосомы выделяли методом центрифугирования [16]. Полученные синаптосомы подвергали осмотическому шоку в дистиллированной воде, после чего синаптические мембраны осаждали при 20000 g в течение 30 мин. После однократной промывки 0,32 М сахарозой препарат мембран хранили при -70°С и использовали для анализа в течение недели. Активность Na, К-АТФазы в мембранах синаптосом оценивали, измеряя количество неорганического фосфата (Рн), освобождающегося в ходе гидролиза АТФ [10]. Инкубационная среда для определения общей АТФазной активности содержала (в мМ/л): 130

- NaCl, 20 — KCl, 3 — MgCl2, 30 — трис-HCl буфер, pH — 7,4, 3 — АТФ и 40 мкг мембранного белка в 1,5 мл конечного объема. При определении активности Мд2+-АТФазы среда инкубации содержала те же компоненты и дополнительно 1 мМ уабаина — специфического ингибитора Na, К-АТФазы. Активность Na, К-АТФазы рассчитывали как разность между общей и Мд2+-зависимой АТФазной активностью. Содержание белка определяли по Лоури.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как видно на рисунке, при ишемии активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом снижается. Ингибирование активности фермента после 30, 60, 90 мин ишемии составило 32,1%, 45,8%, 53,7% относительно контроля (ложнооперированные животные) соответственно. Таким образом, степень ингибирования фермента зависит от длительности ишемии.

Ингибирование фермента снижает трансмембранные градиенты ионов, вызывает чрезмерное поступление в нейроны Na+ с последующим притоком Cl- и воды, что приводит к клеточному отеку. Обнаружена корреляция между ингибированием Na, К-АТФазы и отёком мозга в ишемизированной области [18].

Ишемия вызывает на клеточном уровне серию быстро развивающихся во времени изменений, которые могут повлиять на Na, К-АТФазу. В их числе ацидоз, перегрузка ионами кальция, активация протеаз, аккумуляция метаболитов липидов (жирных кислот, лизолипидов) и в некоторых тканях, транслокация ферментного белка с поверхности мембраны внутрь клетки [14]. Не исключено также, что обнаруженное нами ингибирование Na, К-АТФазы связано с потерей связи фермента с цитоскелетом. Цитоплазматический домен а-субъединицы Na, К-АТФазы связан с анкирином, который связывает фермент с элементами примембранного цитоскелета (фодрино-выми фибриллами). Такая связь с цитоскелетом стабилизирует Na, К-АТФазу в плазматической мембране. а-Фодрин и анкирин являются субстратами кальпаинов — группы нелизосомальных Ca2+-зависимых протеаз. Показано, что на раннем этапе реперфузии (5 мин) после тотальной ишемии миокарда резкое снижение активности Na, К-АТФазы связано с активацией кальпаинов, что приводит к деградации цитоскелетных белков и нарушению их связи с ферментом [17]. Активация селективного протеолиза а-фодрина под действием кальпаинов обнаружена в синаптосомах из мозга крыс при ишемии и реперфузии [15].

Ингибирование активности фермента при ишемии может происходить под действием активных форм кислорода (АФК), окислительной модификации липидного микроокружения и накопления продуктов их деградации, изменения редокс-состояния окружения, фосфорилирования субъединиц [19]. При ишемии Na, К-АТФаза функционирует в условиях высокой концентрации АФК, которые приводят к ингибированию гидролитической и транспортной функции Na, К-АТФазы. На частично очищенном препарате фермента из синаптосом мозга показано, что степень ингибирования Na, К-АТФазы зависит от вида АФК [11].

Рис. Изменение активности Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии/реперфузии и введении даларгина: Светлый столбик - контрольные (ложнооперированные) животные; серые столбики - ишемия и реперфузия; столбики с косой штриховкой - введение даларгина в дозе 100 мкг/кг; дважды заштрихованные столбики - введение даларгина в дозе 500 мкг/кг. * - р < 0,05 относительно контроля; ** - р < 0,05 относительно ишемии 60 мин; +— р < 0,05 относительно ишемии 60 мин + реперфузия 60 мин.

Данные для построения рисунка

Исследование фермента в постишемическом периоде показало, что снятие лигатуры и восстановление кровоснабжения мозга после 60 мин ишемии приводит к повышению активности Na, К-АТФазы. Через 60 мин реперфузии активность фермента возрастает на 45,9%, а после 90 мин -на 59,9% относительно ишемии. Таким образом, при ишемии/реперфузии происходит обратимое ингибирование Na, К-АТФазы. Это позволяет предположить, что ингибирование фермента при ишемии связано с изменением редокс-состояния тиоловых групп и/или фосфорилирования субъединиц, которое может привести к обратимой интернализации Na, К-АТФазы в клатрин окаймленные везикулы [12] и уменьшению количества ее молекул на синаптической мембране.

Введение даларгина в дозе 0,1 мг/кг за 30 мин до ишемии не оказало влияние на активность Na, К-АТФазы после 60 мин ишемии (рис.). В дозе 0,5 мг/кг активность фермента после 60 мин ишемии на 25% выше, чем при ишемии без введения пептида. Таким образом, даларгин, в дозе проникающей в головной мозг, защищает Na, К-АТФазу синаптических мембран от ишемического повреждения.

В связи с полученными нами результатами интерес представляют данные литературы о влиянии даларгина на сердечно-сосудистую систему. Внутривенное введение даларгина вызывало увеличение частоту сердечных сокращений как у человека (25-100 мкг/кг), так и у крыс (100 мкг/кг), и этот эффект не проявлялся в условиях блокады опиоидных рецепторов налоксоном [4, 6]. Показано, что курсовое введение даларгина вызывает снижение удельного периферического сопротивления [8], оказывает венодилятирующее действие, а также уменьшает потребление кислорода организмом. Считают, что даларгин, являясь р-агонистом опиоидных рецепторов, вызывает вазодилятацию и снижение артериального давления за счет увеличения продукции NO эндотелием [6]. Кроме того, внутривенная инфузия пептидных агонистов р-опиоидных рецепторов вызывала у наркотизированных крыс снижение общего периферического сопротивления и артериального давления. Подобных опиоид-индуцированных изменений показателей центральной гемодинамики не происходит в условиях блокады NO-синтазы. Исходя из этих данных можно предположить, что благоприятный эффект даларгина при ишемии связан как со снижением потребности клеток мозга в кислороде, так и с улучшением кровоснабжения мозга за счет интенсификации коллатерального кровоток благодаря сосудорасширяющему эффекту пептида.

Даларгин способен оказать и антиоксидантный эффект. Показано, что пептид при внутривенном введении способен снижать активность ксанти-ноксидазы мозга [2], катализирующей образование супероксиданионрадикала и пероксида водорода.

Таким образом, ишемия, в зависимости от ее длительности, приводит к ингибированию активности Na, К-АТФазы мембран синаптосом. В период реперфузии активность фермента восстанавливается. Внутрибрюшинное введение даларгина до ишемии в дозе 0,5 мг/кг, предотвращает ингибирование фермента при ишемии.