Влияние дисперсного состава полифенолов на эффективность их инкапсуляции методом комплексной коацервации

Растительные полифенолы представляют собой огромный класс соединений, многие из которых проявляют выраженные биоактивные свойства, такие как антиоксидантные, противовоспалительные, иммуностимулирующие, противораковые и другие. Вместе с тем, реальное использование этих веществ ограничено в связи с их низким уровнем биодоступности, плохой растворимостью в воде, что в совокупности ограничивает проявление биологической активности в условиях доставки в организм человека.

Для решения этой проблемы учеными сегодня предпринимаются попытки минимизировать барьерные факторы в части использования полифенолов в составе биологически активных добавок и пищевых систем. Одним из таких подходов является микронизация полифенолов.

Термин «микронизация» был описан J.T. Joshi [9] и определяется как уменьшение размера частицы до менее десяти микрон, достигаемое с помощью различных механизмов. Методы микронизации могут включают использование гидродинамических и механи- ческих типов воздействия для разрушения внутренних связей отдельных частиц.

Уменьшение размера частиц до микронного уровня сопровождается изменением структурных, физико-химических и функциональных свойств. Такие свойства, как растворимость, водопоглощение, намокаемость и набухаемость, реакционная способность улучшаются в микронном масштабе, в первую очередь, благодаря увеличению площади поверхности взаимодействия твердых частиц и растворителя [7].

Выделяют два принципиальных подхода к получению микрочастиц: метод «сверху вниз», когда более крупные частицы уменьшаются до меньшего размера и метод «снизу вверх», когда микрочастицы строятся из молекул в растворе [14]. Способы получения сверхтонких субмикронных суспензий биологически активных веществ методами «сверху вниз», как правило, основаны на использовании высоких сдвиговых усилий, кавитации и измельчения и предполагают использование такого оборудования, как гомогенизаторы, мельницы, микрофлюидизаторы, ультразвуковые генераторы [1, 9]. Каждый из этих методов характеризуется своими преимуществами и недостатками, определяющими возможности и ограничения реального использования этих методов.

Для технологии инкапсуляции дисперсный состав инкапсулируемых частиц может иметь огромное значение. Некоторые исследования показывают, что предварительная микронизация позволяет получить капсульные системы меньшего размера, что важно для дальнейшей эффективной доставки этих соединений в организм человека.

Целью настоящего исследования была оценка влияние микронизации с помощью низкочастотного ультразвука на дисперсный состав куркумина и рутина и установление эффективности инкапсуляции микронизиро-ванных веществ методом комплексной коацервации.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовали полифенолы рутин и куркумин (рис. 1).

Куркумин ((1Е,6Е)-1,7-бис(4-гидрокси-3-метоксифенил)гепта-1,6-диен-3,5-дион) обладает низким уровнем токсичности и большим фармакологическим потенциалом, включая антиоксидантные свойства, противовоспали- тельные, антибактериальные и противораковые свойства [2, 3, 6, 8, 10]. При этом курку-мин практически нерастворим в холодной воде при кислом и нейтральном pH, но растворим в некоторых органических растворителях, например, в этаноле, ацетоне и хлороформе, а также в щелочи (pH > 12) или в чрезвычайно кислых растворителях, таких как ледяная уксусная кислота.

Рутин (кверцетин-3-рутинозид (3', 4', 5,7-тетрагидроксифлавон-3в-d-рутинозид)) представляет собой фенольное соединение с хорошо изученным терапевтическим потенциалом и высокой безопасностью. Рутин обладает несколькими потенциально полезными эффектами на организм человека, включая анти-радикальное, противовоспалительное, противоопухолевое действие и свойства укрепления кровеносных капилляров [11, 13, 16].

а)

б)

Рис. 1. Структурная формула молекул куркумина (а) и рутина (б)

Микронизацию проводили с использованием низкочастотного ультразвука, используя режим обработки 630 Вт и 7 мин, при контроле температуры не более 50 °С. Данный режим был определен в рамках ранее проведенных исследований [12]. Вели обработку 0,1 % водных растворов веществ.

Инкапсуляцию полифенолов проводили путем их внесения в установленном количе- стве в предварительно подготовленный водный раствор желатина (2 мас. %/об.) в условиях механического перемешивания при скорости 500 об/мин в течение 15 мин. Затем в полученную суспензию был внесен водный раствор пектина (2 мас. %/об.) и созданы условия для коацервации путем изменения значения рН с применением 0,5н раствора HCl.

При этом отслеживалось влияние соотношения полифенолы : (желатин + пектин) на дисперсный размер полученных капсул. В исследовании использовались соотношения 1:2 и 1:20 (избыточное количество инкапсулирующего вещества) по массе.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ) определяли как отношение БАВ, инкапсулированных, к количеству БАВ, оставшемуся на поверхности капсул. Коротко, к 0,2 г полученной суспензии добавляли 1 мл этанола и аккуратно перемешивали, затем определяли содержание БАВ в надосадочной жидкости.

Эффективность инкапсуляции в процентах рассчитывали по формуле:

ЭИ (%) = ^*100, (1) где Х1 - общее содержание БАВ (после процедуры разрушения капсул), мг; Х0 - содержание неинкапсулированного БАВ, мг; Х2 -количество БАВ, добавленное при инкапсуляции, мг.

Дисперсный состав определяли методом лазерного динамического светорассеяния.

Результаты исследования

Результат определения дисперсного состава полифенолов в исходном виде показал, что выбранные для исследования образцы веществ в общей массе представляют смесь частиц разного размера, с преимущественным содержанием частиц 325 нм для рутина и 405 нм для куркумина (рис. 2). При этом в обеих системах было отмечено присутствие частиц более крупного размера, в диапазоне 2500– 5500 нм, что, вероятно, обусловлено процессами полимеризации полифенолов.

Известно, что полифенолы - это вещества, стремящиеся к процессу полимеризации, в результате чего существенно снижается их биологическая активность, в том числе антиоксидантные свойства, поскольку часть функциональных групп не проявляет свой вклад в формирование антиоксидантной активности [2, 3].

Для выравнивания дисперсного состава частиц полифенолов и уменьшения размера частиц в целом было использовано ультразвуковое воздействие.

При обработке ультразвуком жидких систем в кавитационном режиме могут возникать различные сопутствующие эффекты, которые связаны с возникновением избыточного давления при схлопывании кавитационных пузырьков. Ранее проведенные нами исследования показали, что ультразвуковая обработка дигидрокверцетина позволяет добиться преобладания мономерных и димерных форм вещества в системе. В свою очередь, процесс микронизации оказывает влияние и на антиоксидантные свойства биологически активных веществ, повышая их [1, 12].

Полученные результаты показали, что использование ультразвуковой обработки в режиме 630 Вт, 7 мин привело к снижению значения среднего размера частиц в водной системе рутина и куркумина. Для куркумина удалось добиться преобладания частиц (189 ± 5) нм, для рутина (158 ± 5) нм.

В дальнейших исследованиях использовали микронизированные образцы полифенолов.

Согласно имеющимся в литературе данным, эффективность инкапсуляции при использовании комплексной коацервации в значительной степени зависит от правильно подобранных условий проведения процесса инкапсуляции, в том числе от соотношения инкапсулируемого вещества и инкапсулирующих материалов [8, 15].

Полученные результаты определения эффективности представлены на рис. 3.

Результаты показали, что уменьшение размера частиц инкапсулируемых полифенолов оказало положительное влияние на рост значений эффективности их инкапсуляции методом комплексной коацервации. При соотношении полифенолов и инкапсулирующих веществ 1:2 эффективность инкапсуляции для микронизированного куркумина составила 43,0 % против 33,6 % - для исходного; для микронизированного рутина - 52,2 %, против 44,8 для исходного.

Увеличение доли инкапсулирующих веществ до соотношения 1:20 позволило значительно увеличить эффективность инкапсуляции для всех образцов полифенолов, примерно в 1,2–1,5 раза. Это вполне объяснимо, так как увеличивается площадь взаимодействия полифенолов с инкапсулирующим материалом.

□.1           1           10         100        1,030       10,000

Size (Nanometers)

a)

0.1           1           10         100        1.030       10.000

Size (Nanometers)

Рис. 2. Характерный вид кривых распределения дисперсного состава частиц полифенолов: а – рутин; б – куркумин

Вместе с тем, некоторые исследования показывают, что при использовании избыточного количества биополимеров, формируемых защитную капсулу для биологически активного вещества, размер получаемых капсул может достигать неприемлемо больших значений.

Нами были проведены исследования по установлению дисперсного состава полученных после инкапсуляции частиц (для микро-низированных полифенолов). Результаты представлены на рис. 4.

Среднее значение гидродинамических диаметров частиц инкапсулированного кур-кумина при избыточном количестве желатина и пектина достигали значений более 2300 нм, для рутина более 1800 нм, тогда как использование соотношения 1:2 привело к формированию частиц менее 1000 нм.

Исследования, представленные в литературе, показывают влияние концентрации инкапсулирующих полимеров на размер получаемых капсул, размер частиц увеличивался с увеличением концентрации полимеров [15].

При этом считается, что 1000 нм – это верхний предел для наночастиц, подходящих для эффективной доставки биологически активных соединений в организм человека [4, 5, 15, 16].

Описанные в литературе подходы указывают на то, что снизить размер частиц при коацервации можно, используя сшивающие агенты. Показана возможность уменьшения размера частиц альгината, инкапсулированного куркумином, при использовании в качестве сшивающего агента CaCl2 [4]. Доказано, что увеличение концентрации поверхностноактивного вещества, используемого при инкапсуляции, приводит к уменьшению размеров получаемых капсул [15].

Заключение

Таким образом, проведенные нами исследования показали целесообразность использования процедуры микронизации полифенолов перед их инкапсулированием. Микронизация с применением ультразвукового воздействия позволила обеспечить уменьшение среднего

Рис. 4. Средний размер частиц инкапсулированных полифенолов

размера частиц более, чем в 2 раза для каждого из полифенолов. Эффективность инкапсуляции микронизированных полифенолов также повышается примерно в 1,2 раза.

Использование избыточного количества инкапсулирующих биополимеров позволило добиться повышения эффективности инкапсуляции в 1,4–1,6 раза. Однако использова- ние такого подхода приводит к росту размера получаемых капсул, что является нежелательным процессом. Максимальные значения эффективности инкапсуляции, которых удалось добиться в рамках данного исследования, составили для микронизированного рутина 76 % и микронизированного куркумина – 64 %.