Влияние доксорубицина на адгезивные свойства кишечных палочек

Он^оло^ичес^ие больные входят в ^р^пп^ высо-^о^о рис^а по развитию инфе^ционных осложнений. Это об^словлено имм^нос^прессивным воздействием химиотерапевтичес^о^о и л^чево^о методов лечения, а та^же т^анью самой оп^холи.

Этиоло^ичес^ая стр^^т^ра инфе^ций в он^оло^ии представлена различными ми^роор^анизмами [5,9]. Среди ^рамположительных ба^терий вед^щими па-то^енами являются ми^роор^анизмы из семейств Staphylococcaceae (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis), Streptococcaceae и Enterococcaceae, среди ^рамотрицательных ба^терий

– представители семейства Enterobacteriaceae и ^р^ппа «неферментир^ющих» ба^терий, в^лючающая различные семейства ми^роор^анизмов, пол^чивших хара^терное название в связи с отс^тствием процесса брожения при ^тилизации ^^леводов [4].

Если среди возб^дителей инфе^ций ^ровото^а и хир^р^ичес^их ран лидерство сохраняется за ^рампо-ложительными ба^териями, то ^рамотрицательные ба^терии часто вызывают ^роинфе^ции и инфе^ции респираторно^о тра^та [5,9].

Подавляющее большинство и ^рамположительных, и ^рамотрицательных возб^дителей инфе^ции ^ он-

^оло^ичес^их больных относятся ^ ^словно пато^ен-ным. Развитие инфе^ции является следствием реализации потенциальных пато^енных свойств этих воз-б^дителей. Известно, что взаимодействие ми^роба-возб^дителя с ^лет^ами ма^роор^анизма начинается с ад^езии. В связи с этим одними из основных фа^-торов вир^лентности ^рамотрицательных ба^терий являются ад^езины – стр^^т^ры, ^частв^ющие в при-^реплении возб^дителя ^ т^ани с послед^ющим развитием ^олонизации и инвазии. Для ^рамотрицатель-ных ба^терий хара^терны та^ называемые фимбриальные ад^езины (специальные бел^овые нитевидные выросты ^леточной стен^и – ворсин^и), обеспечивающие более эффе^тивн^ю ад^езию, чем афим-бриальные ад^езины ^рамположительных ба^терий [8]. Процесс специфичес^ой ад^езии ^а^ рез^льтат ли^анд-рецепторно^о взаимодействия обеспечивает целый ^ас^ад ^леточных реа^ций ^а^ со стороны са-мо^о ми^роба, та^ и со стороны ^лет^и ма^роор^а-низма. Нар^шение процессов ад^езии с^щественно снижает пато^енный потенциал возб^дителя.

Возни^новение инфе^ции ^ он^оло^ичес^их больных на фоне проведения противооп^холевой химиотерапии треб^ет своевременно^о назначения анти-ми^робных химиопрепаратов. Пос^оль^^ представители семейства Enterobacteriaceae, в том числе E.coli, являются одними из основных возб^дителей инфе^-ций в он^оло^ии, представляет интерес из^чение влияния противооп^холевых и антими^робных препаратов на вир^лентность данно^о вида ми^роор^анизмов, в частности ад^езивн^ю а^тивность.

Материалы и методы. Из^чено сочетанное влияние противооп^холево^о препарата до^сор^-бицина из ^р^ппы антраци^линов, широ^о применяемых при химиотерапии оп^холей, и антибиоти-^а из ^р^ппы амино^ли^озидов – ами^ацина, эф-фе^тивно^о при инфе^циях, вызванных ^рамотри-цательной флорой, на ад^езивные свойства ^и-шечных палоче^. В опыт было взято 5 штаммов: стандартный – E. coli ATCC 25922 и четыре ^лини-чес^их, выделенные из ^нойно^о отделяемо^о послеоперационных ран.

В предварительных э^спериментах методом дв^-^ратных серийных разведений в мясо-пептонном б^льоне при ^онцентрации до^сор^бицина и ами^а-цина от 1000 до

0,37 м^^/мл был ^становлен ^ровень антими^-робной а^тивности взятых в опыт препаратов – минимальная ин^ибир^ющая ^онцентрация (МИК) [7]. Ми^робная на^р^з^а составляла 200 тыс. м. т. / мл по стандарт^ м^тности ГИСК им. Т. А. Тарасевича. Контролем сл^жил мясо-пептонный б^льон без препарата. Рез^льтаты ^читывали по наличию или отс^тствию видимо^о роста после ин^^бации посевов в термостате при t 370С в течение 24 часов. Тем же методом был ^становлен ^ровень анти -ми^робной а^тивности ами^ацина в прис^тствии с^бин^ибир^ющих ^онцентраций (Ѕ и ј МИК) до^-сор^бицина. Для из^чения развития ^стойчивости ^ ами^ацин^ и влияния на этот процесс до^сор^-бицина опытные штаммы пассировали в мясо-пептонном б^льоне при постоянной и возрастающей ^онцентрации ами^ацина в прис^тствии Ѕ и ј МИК до^сор^бицина. В этих э^спериментах ми^робная на^р^з^а составляла 200 тыс. м. т. / мл по стандар-т^ м^тности ГИСК им. Т. А. Тарасевича. Все^о было проведено 10 пассажей.

У исходных и пассажных вариантов определяли ад^езивн^ю а^тивность по их способности адсорбироваться на поверхности эритроцитов чело-ве^а О (I) ^р^ппы, Rh (+) [1, 6]. Для это^о свежие эритроциты дважды отмывали физиоло^ичес^им раствором хлорида натрия при 300 об./мин в течение 15 мин^т. Из отмытых эритроцитов в физиоло-^ичес^ом растворе ^отовили взвесь ^онцентраци-ей 100 млн ^лето^ / мл. При^отовленн^ю эритро-цитн^ю взвесь по 0,1 мл добавляли ^ 1 мл с^точ-ной б^льонной ^^льт^ры из^чаемых штаммов, содержащей 3Ч108 м. т. После ин^^бации смеси в термостате при t 370С в течение 30 мин^т из нее ^ото-вили маз^и способом «толстая ^апля», ^оторые выс^шивали при t 370С, фи^сировали в этаноле 15 мин^т, о^рашивали водным ф^^сином в течение 5 мин^т и просматривали с использованием масля-но^о иммерсионно^о объе^тива (Ч90) ми^рос^опа «Биолам». В ^аждом маз^е подсчитывали ^оличе-ство эритроцитов, ^частвовавших в ад^езии, ^оли-чество ми^роор^анизмов, адсорбировавшихся на одном эритроците (оценивали по 5 эритроцитов в 5 полях зрения). Из пол^ченных данных рассчитывали средний по^азатель ад^езии (СПА).

Ми^роор^анизмы при СПА 1,01-2,0 считали низ-^оад^езивными, 2,01-4,0 –среднеад^езивными, более 4,0 – высо^оад^езивными. Статистичес^^ю обработ-^^ проводили cо^ласно методи^е оцен^и с^ществен-ности различий межд^ найденными в опыте величинами [2].

Рез^льтаты. Все взятые в опыт штаммы E. coli по значению МИК были высо^о ч^вствительны ^ ами-^ацин^. МИК для штамма E. coli ATCC 25922 составила 1,5 м^^/мл, для четырех ^линичес^их с лабораторным шифром № 23, № 607, № 733 и № 822 – 6, 2 м^^/мл.

В прис^тствии ј МИК до^сор^бицина ч^вствитель-ность ^ ами^ацин^ изменилась лишь ^ дв^х взятых в опыт ^линичес^их штаммов. Для штамма № 23 она повысилась в 2 раза (МИК 6,2 и 3,1 м^^/мл соответственно), а для штамма № 822 – в 8 раз (МИК 6,2 и 0,75 м^^/мл).

В прис^тствии Ѕ МИК до^сор^бицина изменения ч^вствительности отмечены ^ ^линичес^их штаммов E. coli. У штаммов № 23 и № 607 они были невели^и (в 2 раза), а ^ штаммов № 733 и № 822 достаточно выражены (в 8-16 раз). Ч^вствитель-ность стандартно^о штамма E. coli АТСС 25922 не изменялась в прис^тствии ^а^ ј, та^ и Ѕ МИК до^со-р^бицина (табл. 1).

Ка^ ^^азывалось выше, ^ исходных и пассажных вариантов из^чавшихся штаммов определяли ад^е-зивн^ю а^тивность. Пол^ченные рез^льтаты приведены в табл. 2. Из нее видно, что со^ласно значениям СПА исходно высо^ой ад^езивной а^тивностью обладал штамм № 607 (СПА 5,0), остальные штаммы имели среднюю ад^езивн^ю а^тивность (СПА штамма E. coli АТСС 25922 3,52, № 23 – 3,32, № 733 – 2,56, № 822 – 2,28). Контрольные варианты трех ^линичес-^их штаммов с^щественно отличались от исходных по значению СПА: для штамма № 23 он снизился до 1,72, для штамма № 607 – до 3,52, для штамма № 822 – до 1,84, одна^о последнее снижение статисти-чес^и недостоверно. Для штамма № 733 величина СПА повысилась до 3,48. Та^им образом, пассажи штаммов E. coli на питательной среде вед^т ^ изменению их ад^езивной а^тивности чаще в сторон^ снижения .

Это свидетельствует о нестабильности данного признака.

При пассажах с возрастающей концентрацией амикацина адгезивная активность по сравнению с контролем достоверно возросла у трех штаммов: E. coli ATCC 25922 (СПА 4,72), № 23 (СПА 4,16) и № 822 (СПА 3,16). Для двух штаммов - № 607 и № 733 указанный показатель остался без существенных изменений. Для упомянутых выше трех штаммов та же закономерность отмечена и при пассажах с постоянной концентрацией амикацина. У двух других штаммов отмеченные различия в величине СПА недостоверны.

Пассажи при возрастающей концентрации амикацина в присутствии S МИКдоксорубицинау всех опытных штаммов не повлияли на ад^езивн^ю а^тивность по сравнению с вариантами, пассированными в этих условиях без цитостатика. Имеющиеся различия несущественны. В то же время при пассажах с возрастающей ^онцентрацией ами^ацина в прис^тствии ј МИК доксорубицина по сравнению с вариантами, пассированными на среде только с амикацином, у двух штаммов - E. coli АТСС 25922 и № 607 величина СПА снизилась с 4,72 до 3,52 и с 3,96 до 2,48 соответ -ственно.

При пассажах с постоянной концентрацией амикацина в присутствии S МИК доксорубицина величина СПА стандартного штамма E. coli АТСС 25922 снизилась с 5,52 до 4,44, а у штамма № 822 произошло ее повышение с 2,8 до 5,68. У трех штаммов № 23, № 607 и № 733 СПА существенно не изменился. Пассажи на средах с постоянной концентрацией амикацина в присутствииj МИК доксорубицина привели ^ повышению ад^езивной а^тивности штаммов № 23, № 607 и № 822 до значений СПА 4,12, 4,76 и 3,84 соответственно при величине этих показателей у вариантов, полученных при пассажах с постоянной концентрацией 3,04, 3,24 и 2,8 соответственно.

Таким образом, в этих экспериментах показана нестабильность признака адгезии у E. coli. Доксорубицин в дозах S и j МИК оказывает разнонаправленное действие на экспрессию генов, ответственных за этот признак.

Высокий уровень антимикробной активности амикацина (МИК от 1,5 до 6,2 мкг/мл) в отношении опытных штаммов E. coli был ожидаем. Именно этим обосновывается высо^ая эффе^тивность применения новых аминогликозидов в лечении инфекций, вызванных грамотрицательной микрофлорой.

Отсутствие антимикробной активности доксорубицина в отношении опытных штаммов E. coli было несколько неожиданно. Очевидно, это обусловлено его плохим проникновением внутрь микробных клеток. Наличие большо^о ^оличества липидов в ^леточной стен^е ^рамотрицательных ба^терий способств^ет быстром^ связыванию препарата ввид^ е^о высо^ой биодоступности. Это ведет к его депонированию в периплазматичес^ом пространстве ми^робной ^лет^и без проникновения в достаточном количестве в цитоплазму. Однако нами установлен синергидный эффект сочетанного действия амикацина и доксоруби- цина во взятых ^онцентрациях в отношении опытных штаммов E. coli, поэтому отмеченные изменения адгезивной активности штаммов E. coli в присутствии S и j МИК доксорубицина при пассажах как с возрастающей, так и с постоянной концентрациями антибиотика могут быть обусловлены проникновением части про-тивооп^холево^о препарата через ^леточн^ю стен^^ в микробную клетку вместе с амикацином, играющим роль «проводника». Итогом этого может быть ДНК-тропное действие доксорубицина, в том числе и на структуры, входящие в «острова патогенности», ответственные за синтез адгезинов, и, как следствие, изменение синтеза соответствующих белков. Отсутствие общих за^ономерностей влияния до^сор^бицина на этот процесс (усиление или ослабление адгезивной активности) обусловлено, очевидно, индивидуальными особенностями каждого опытного штамма и нестабильностью соответствующих генов. Это подтверждают и литературные данные о противоречивом влиянии ДНК-тропных соединений на генетический аппарат бактерий, в том числе и реализацию генетической информации патогенных локусов [3].

Выводы:

• 1.    Доксорубицин обладает низкой антимикробной активностью в отношении E. coli.

• 2.    Доксорубицин в субингибирующих концентрациях (S и j МИК) вызывает повышение чувствительности E. coli к амикацину. Это позволит умеренно снижать дозы антибиотика при лечении инфекций, вызванных данным видом микроорганизмов, у онкологических больных, получающих химиотерапию препаратами антрациклинового ряда.

• 3.    Доксорубицин в субингибирующих концентрациях (S и j МИК) оказывает разнонаправленное влияние на адгезивные свойства E. coli. Это может способствовать формированию штаммов c измененной вирулентностью, что следует учитывать в клиничес-^ой пра^ти^е

Таблица 1

Сочетанное действие ами^ацина и до^сор^бицина на опытные штаммы E. coli

Штамм	МИК амикацина, мкг/мл	МИК амикацина (мкг/мл) в присутствии доксорубицина
		% МИК	% МИК
E. coli АТСС 25922	1,5	1,5	1,5
E. coli № 23	6,2	3,1	3,1
E. coli № 607	6,2	3,1	6,2
E. coli № 733	6,2	0,75	6,2
E. coli № 822	6,2	0,37	0,75

Таблица 2

Значения СПА пассажных вариантов ^ишечных палоче^

Условия пассажа	СПА после пассажей
	E. coli ATCC 25922	№ 23	№ 607	№ 733	№ 822
Исх	3,52	3,32	5,0	2,56	2,28
К	3,32	1,72x	3,52x	3,48x	1,84
Амп	5,52xx	3,04xx	3,24	3,2	2,8xx
Амв	4,72xx	4,16xx	3,96	3,36	3,16xx
Амп+Д1/2	4,44	3,56	3,8	2,92	5,68xxx
Амп+Д1/4	4,12xxx	4,12xxx	4,76xxx	3,72	3,84xxx
Амв+Д1/2	4,4	4,52	3,24	3,4	3,76
Амв+Д1/4	3,52xxx	4,96	2,48xxx	3,52	3,6
Д1/2	3,64	4,76xx	4,28	2,92	2,56

Примечание . Амп – постоянная ^онцентрация ами^ацина; Амв – возрастающая ^онцентрация ами^ацина; Д1/2 – до^сор^бицин в ^онцентрации Ѕ МИК; Д1/4 – до^сор^бицин в ^онцентрации ј. МИК, К – ^онтроль (пересевы на среде без ами^ацина и до^сор^бицина); ^x – различия ^онтрольно^о и исходно^о варианта с^щественны, ^xx – различия ^р^ппы и ^онтроля с^щественны, ^xxx – различия ^р^ппы и вариантов Амп и Амв с^щественны.