Влияние долгосрочного хранения на жизнеспособность и свойства штаммов Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов ФГБНУ ВНИИФ

Оригинальная статья / Original article УДК: 632.4(089)

Коллекция ФГБНУ ВНИИФ служит для хранения фитопатогенных микроорганизмов и поддержания их в жизнеспособном состоянии [1,2]. В ней проводятся исследования по поиску новых способов хране- ния микромицетов, при которых они даже после длительного содержания в неблагоприятных условиях могут в полном объеме возобновляться без потери вирулентности и агрессивности [3,4].

В последние годы возбудители грибных болезней растений, принадлежащие к родам Bipolaris, Fusarium и Alternaria, встречаются практически во всех ареалах возделывания культурных растений, причиняя им значительный вред [5]. Эти грибы поражают разные виды сельскохозяйственных растений, вызывая гибель всходов, отставание в росте, увядание, щуплость семян, загнивание корней и клубней. Потери урожая от этих патогенов ежегодно составляют 10-15%, а в годы эпифитотий до 45%. Зараженные семена имеют очень низкую энергию прорастания и часто теряют всхожесть. При использовании зерна пшеницы с «черным зародышем» меняется цвет муки, ухудшается товарная ценность и хлебопекарные свойства. В сельскохозяйственной продукции, зараженной этими грибами, накапливаются микотоксины [6-8].

Основными причинами высокой вредоносности грибов из родов Bipolaris, Fusarium и Alternaria в России являются несоблюдение агротехники, отсутствие устойчивых сортов, неэффективность химического метода защиты и высокая способность к адаптации патогенов к условиям окружающей среды. При этом наиболее экономически выгодным и экологически безопасным способом борьбы является возделывание толерантных сортов [9].

Известно, что в условиях длительного хранения грибов на агаровой питательной среде происходит постепенная утрата их патогенных свойств. Необходимость сохранения коллекционного материала с неизменными патогенными свойствами диктуется возможностью корректного проведения исследований, включающих разработку методов биологической защиты, мониторинг динамики развития патогенов, оценку их вирулентности и агрессивности, отбора селекционного материала, толерантного к болезням и т.п. [10, 11].

В последние годы болезни, вызываемые несовершенными грибами, принадлежащими к родам Bipolaris , Fusarium и Alternaria , значительно расширили свои ареалы и причиняют значительный вред сельскому хозяйству.

Целью наших исследований являлась оценка жизнеспособности, патогенности и фитотоксичности штаммов Alternaria alternata , Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani после длительного хранения в лиофильном состоянии на полосках фильтровальной бумаги в условиях низких положительных и ультранизких температур.

Материал и методы исследования

Материалом для исследований служили штаммы Alternaria alternata , Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani , выделенные из пораженных образцов пшеницы, ячменя и картофеля. Образцы пораженных растений собраны в Северо-Кавказском, Волго-Вятском и Центральном экономических районах России (табл. 1).

Способность грибов к возобновлению полноценных видовых характеристик на питательной среде изучали после длительного хранения биоматериала, высушенного с помощью метода лиофилизации на фильтровальной бумаге. Метод заключался в следующем: полоски фильтровальной бумаги (3-4 мм х 45-50 мм) помещали на поверхность картофельно-глюкозного агара (КГА) в чашках Петри и засевали спорами гриба. После того, как полоски зарастали мицелием, их в асептических условиях снимали пинцетом и лиофильно высушивали. Подготовленные таким образом полоски (по 2-5 шт. одного штамма гриба) переносили в сте-

Таблица 1. Происхождение использованных в исследовании штаммов Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani Table 1. Origin of the Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana and Fusarium solani strains used in the study

Вид гриба Штамм Культура Происхождение (год, регион, область) Alternaria alternata Крт-10л-2 Пшеница 2010, Сев.-Кавказский, Краснодарский кр Alternaria alternata Мр-14-2 Ячмень 2014, Волго-Вятский, Мордовия Alternaria alternata МРТ 4л-6 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Alternaria alternata МРЧ 2л-4 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Alternaria alternata МРЧ 2л-3 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Bipolaris sorokiniana Ru10-08-2 Ячмень 2010, Сев.-Кавказский, Краснодарский кр Bipolaris sorokiniana МРД 3/4 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Bipolaris sorokiniana МРД 3/5 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Bipolaris sorokiniana МРД 3/7 Ячмень 2012, Волго-Вятский, Мордовия Fusarium solani МПК-13 Пшеница 2012, Волго-Вятский, Мордовия Fusarium solani 100021 Картофель 2001, Центральный, Московская Fusarium solani FSL-9 Картофель 2002, Центральный, Московская рильные пластиковые пробирки объемом 2,5 мл и помещали в бытовой холодильник при +40С и в морозильную камеру при -80°С.

О жизнеспособности грибов после хранения в указанных условиях судили по их способности образовывать спорообразующие колонии на КГА в чашках Петри. Для этого после процедур, связанных с выведением гриба из анабиоза, с соблюдением стерильности полоски лиофилизированной бумаги разрезали на 8-10 фрагментов и раскладывали на поверхности питательной среды в чашках Петри. Наблюдения за развитием мицелия проводили ежедневно. Количество спор подсчитывали в камере Горяева.

Патогенные и фитотоксические свойства штаммов изучали на проростках пшеницы сорта Хакасская, используя метод биопробы на семенах [12, 13]. Для определения патогенных свойств штаммов семена тест-объекта проращивали в суспензиях конидий (106 спор/мл), для выявления фитотоксических свойств штаммов - в фильтрате культуральной жидкости (ФКЖ). О патогенности суспензий конидий и токсических свойствах ФКЖ судили по степени ингибирования длины корней тест-объекта. Длина корней в опытном варианте от 0 до 30% свидетельствует о сильной патогенной (П) и о сильной токсической (Т) активности гриба; от 31 до 50% - умеренной патогенности (УП) и умеренной токсичности (УТ); от 51 до 70% – слабой патогенности (СП) и слабой токсичности (СТ); от 71 до 100% – о непатоген- ных (НП) и нетоксичных (НТ) свойствах изолятов. Контролем служили показатели длины корней, полученные при проращивании семян пшеницы в воде, его принимали за 100%.

Результаты исследований и их обсуждение

В результате длительного хранения в лиофильном состоянии штаммов Alternaria alternata , Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani была установлена достаточно высокая воспроизводимость их морфолого-культуральных свойств после выведения из анабиоза и посева на питательные среды [14]. Практически все культуры после хранения в условиях низких положительных и ультранизких температур возобновляли рост на питательных средах. Колонии грибов во всех вариантах опытов соответствовали морфолого-культуральным свойствам видов [15, 16, 17, 18, 19, 20]. Что касается штаммов Fusarium solani МПК-13 и Alternaria alternata МРТ 4л-6, хранившихся в течение 111 и 95,5 месяцев в холодильнике при +4°С, то была установлена потеря жизнеспособности, при этом ни на одном фрагменте зараженной фильтровальной бумаги роста мицелия обнаружено не было.

Для оценки способности к спорообразованию отбирали штаммы грибов, формирующие полноценные колонии. В вариантах опыта проверялось от 8 до 12 таких колоний грибов. Средние значения по количеству спор на чашку Петри приведены в таблице 2.

Таблица 2. Жизнеспособность и спорообразование штаммов Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani после хранении на фильтровальной бумаге при +4°С и -80°С

Table 2. Viability and sporulation of Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana and Fusarium solani strains after storage on filter paper at +4°C and -80°C

Штамм	Срок хранения, мес.	Жизнеспособность		Спорообразование (кол-во спор/чашку Петри)
		+4°С	-80°С	До хранения	+4°С	-80°С
Alternaria alternata
Крт-10л-2	86	+	+	1,6 х 108	0,9 х 108	1,9 х 108
Мр-14-2	65	+	+	6,3 х 106	4,1 х 106	6,1 х 106
МРТ 4л-6	95,5	-	+	20,1 х 106	-	19,3 х 106
МРЧ 2л-4	96	+	+	13,4 х 106	10,4 х 106	13,0 х 106
МРЧ 2л-3	96	+	+	9,0 х 106	7,6 х 106	9,2 х 106
Bipolaris sorokiniana
Ru10-08-2	76	+	+	2,6 х 107	1,5 х 107	2,9 х 107
МРД 3/4	129	+	+	3,1 х 106	3,1 х 106	3,0 х 106
МРД 3/5	129	+	+	5,6 х 106	5,6 х 106	6,2 х 106
МРД 3/7	129	+	+	4,4 х 106	2,9 х 106	4,5 х 106
Fusarium solani
МПК-13	111	-	+	1,5 х 107	-	2,0 х 107
100021	120	+	+	2,7 х 109	1,8 х 109	2,4 х 109
FSL-9	120	+	+	3,3 х 108	2,5 х 108	3,2 х 108

Таблица 3. Патогенные свойства штаммов Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani после хранении на фильтровальной бумаге при +4°С и -80°С

Table 3. Pathogenicity of Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana and Fusarium solani strains after storage on filter paper at +4°C and -80°C

Штамм	До хранения		Хранение на фильтровальной бумаге при +4°С		Хранение на фильтровальной бумаге при -80°С
	длина корня, %	уровень патогенной активности	длина корня, %	уровень патогенной активности	длина корня, %	уровень патогенной активности
Alternaria alternata
Крт-10л-2	106,4±3,7	НП	100,3±3,2	НП	103,7±2,9	НП
Мр-14-2	89,1±2,4	НП	90,3±1,5	НП	88,4±2,5	НП
МРТ 4л-6	104,6±4,1	НП	-	-	100,3±4,1	НП
МРЧ 2л-4	64,7±2,5	СП	74,9±2,8	НП	68,5±2,7	СП
МРЧ 2л-3	94,7±3,8	НП	92,7±3,5	НП	99,7±2,6	НП
Bipolaris sorokiniana
Ru10-08-2	66,7±4,1	СП	70,8±4,0	НП	68,6±3,8	СП
МРД 3/4	79,1±5,6	НП	76,7±4,1	НП	72,7±4,2	НП
МРД 3/5	25,4±3,4	П	32,3±3,4	УП	26,9±4,0	П
МРД 3/7	62,7±6,4	СП	66,6±3,8	СП	60,6±3,7	СП
Fusarium solani
МПК-13	101,4±4,0	НП	-	-	105,2±3,6	НП
100021	104,6±4,6	НП	102,2±3,5	НП	98,7±5,0	НП
FSL-9	100,5±3,1	НП	90,8±3,0	НП	101,1±2,7	НП

Установлено, что хранение штаммов микромицетов в морозильной камере при -80°С не оказывало негативного влияния на способность колоний к спорообразованию. На 14 сутки культивирования на питательной среде колонии штаммов грибов формировали конидии в количествах, близких к исходным культурам. При хранении штаммов в лиофилизированном состоянии в холодильнике при +4°С отмечали некоторое уменьшение числа образуемых конидий.

Сравнение результатов, полученных после обработки семян пшеницы споровыми суспензиями штаммов Alternaria alternata , Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani , не выявило существенных различий по показателю патогенности между вариантами «До хранения» и «Хранение на фильтровальной бумаге при +4°С и при -80°С» (табл. 3). Возможно, это связано с невысокой патогенной активностью штаммов грибов, взятых для исследований. В любом случае, полученные результаты показывают, что режимы хранения не оказали влияния на усиление патогенных свойств данных штаммов грибов.

При оценке фитотоксических свойств штаммов грибов картина несколько изменилась (табл. 4). Несмотря на то, что средние значения показателей длины корней в вариантах были в ряде случаев сравнимыми, степень фитотоксической активности была выше у исходных штаммов грибов. ФКЖ этих штаммов вызывали резкое угнетение роста корней – 18,7-33%. Особенно четкие различия между штаммами грибов заметны при сравнении вариантов «До хранения» и «Хранение на фильтровальной бумаге при +4°С». В последнем уровень фитотоксической активности штаммов заметно снижался. В вариантах «До хранения» и «Хранение на фильтровальной бумаге при -80°С» различия выражены слабо.

Таким образом, установлено, что длительное хранение штаммов разных видов грибов в лиофильно высушенном состоянии, как в условиях низких положительных и ультранизких температур не оказывало критического негативного влияния на их жизнеспособность. Однако при хранении при +4оС два штамма не возобновили рост.

Сравнение степени патогенности у штаммов грибов до проведения эксперимента и после хранения не выявило между вариантами существенных различий.

При изучении влияния ФКЖ штаммов Alternaria alternata , Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani на развитие проростков тест-культуры было установлено дифференцирующее влияние при режиме хранения при +4оС, которое выражалось некоторым ослаблением фитотоксического эффекта. Показатели фитотоксичности штаммов грибов, полученные в вариантах «до» и «после хранения в условиях ультранизких температур» практически не различались.

Таблица 4. Фитотоксические свойства штаммов Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana и Fusarium solani после хранении на фильтровальной бумаге при +4°С и -80°С

Table 4. Phytotoxic properties of Alternaria alternata, Bipolaris sorokiniana and Fusarium solani strains after storage on filter paper at +4°C and -80°C

Штамм	До хранения		Хранение на фильтровальной бумаге при +4°С		Хранение на фильтровальной бумаге при -80°С
	длина корня, %	уровень фитотоксической активности	длина корня, %	уровень фитотоксической активности	длина корня, %	уровень фитотоксической активности
Alternaria alternata
Крт-10л-2	28,0±2,1	Т	51,7±2,7	СТ	39,0±3,2	УТ
Мр-14-2	21,1±2,0	Т	36,7±1,8	УТ	28,1±2,1	Т
МРТ 4л-6	23,4±2,5	Т	-	-	25,7±1,6	Т
МРЧ 2л-4	29,9±2,8	Т	38,9±2,0	УТ	32,5±2,3	УТ
МРЧ 2л-3	42,5±2,5	УТ	46,7±3,3	УТ	40,8±3,0	УТ
Bipolaris sorokiniana
Ru10-08-2	33,0±3,4	УТ	53,2±3,0	СТ	49,1±3,5	УТ
МРД 3/4	25,0±1,3	Т	23,5±1,4	Т	23,9±2,1	Т
МРД 3/5	34,5±1,6	УТ	33,4±1,4	УТ	43,1±2,4	УТ
МРД 3/7	12,1±1,8	Т	13,4±2,0	Т	22,2±1,9	Т
Fusarium solani
МПК-13	16,6±1,4	Т	-	-	17,3±1,1	Т
100021	18,7±2,0	Т	38,4±2,2	УТ	21,4±3,2	Т
FSL-9	21,2±2,2	Т	30,2±2,1	УТ	27,8±2,0	Т

Заключение

Результаты исследования показали, что метод лиофилизации биоматериала,в том числе несовершенных видов грибов, для длительного хранения при низких положительных и ультранизких температурах является актуальным и востребованным не только в коллекциях микроорганизмов, но и во многих научно- производственных учреждениях. Хранение при -80°С является предпочтительным для сохранения жизнеспособности и свойств грибных изолятов. Метод хранения в условиях бытового холодильника также заслуживает внимания тем, что не требует дорогостоящего и энергозатратного оборудования.

Об авторах:

Aboutthe Authors:

Natalya S.Zhemchuzhina – Cand. Sci. (Biology),

Senior Researcher of State Collection of Phytopathogenic Microorganisms,

403X , SPIN-code: 8007-4601,

Marina I.Kiseleva – Cand. Sci. (Biology),

Senior Researcher of Department of Mycology and Immunity,

ISSN 2618-7132 (Online) Овощи России №6 2024      [ 116 ] Vegetable crops of Russia №6 2024 ISSN 2072-9146 (Print)