Влияние дозы лираглутида на эффективность коррекции микроциркуляторных нарушений при абсолютной инсулиновой недостаточности у белых крыс

¹Введение. В настоящее время во всем мире наблюдается беспрецедентный рост заболеваемости сахарным диабетом, а также ассоциированных с ним сосудистых осложнений [1]. Микро- и макроангиопатии являются одной из основных причин инвалидности и смертности при сахарном диабете, развитие которых, как правило, начинается с поражений сосудов микроциркуляторного русла [2]. Это обусловлено высокой ролью последнего в обеспечении транскапиллярного обмена [3]. В результате расстройства кровообращения на уровне микроциркуляции возникают трофические нарушения с вовлечением крупных сосудов и нервных стволов в патологический процесс, что приводит к нарушению сосудистой иннервации и прогрессированию осложнений [4].

Известно, что одним из ключевых факторов риска развития сосудистых осложнений сахарного диабета является эндотелиальная дисфункция, возникающая под влиянием хронической гипергликемии, дислипидемии и окислительного стресса [5]. Это определяет эндотелий как одну из терапевтических мишеней при лечении пациентов с сахарным диабетом. Особое значение эффективная коррекция микро-циркуляторных нарушений приобретает у больных диабетом I типа, сопровождающимся абсолютной инсулиновой недостаточностью. Это связано с тем, что коррекция гипергликемии у этой категории больных осуществляется заместительной терапией инсулином, который оказывает негативное влияние на эн-дотелий-зависимую дилатацию сосудов, способствуя развитию эндотелиальной дисфункции, а следовательно, и прогрессированию микроциркуляторных нарушений [6]. Именно поэтому целесообразно изучение ангиопротекторных свойств альтернативных сахароснижающих препаратов, в частности аналогов инкретинов, таких как глюкагоноподобный пептид-1 (ГГП-1), обладающих инсулиннезависимым механизмом действия у пациентов с I типом сахарного диабета.

В настоящее время доказана высокая эффективность в коррекции гликемического профиля при лечении пациентов с сахарным диабетом II типа ли-раглутида [7]. Вместе с тем некоторыми авторами показаны положительные эффекты лираглутида и при сахарном диабете I типа, такие как снижение уровня гликированного гемоглобина, концентрации глюкозы, массы тела, а также потребности больных в инсулине [8]. Кроме того, имеются некоторые данные, согласно которым лираглутид обладает непосредственным ангиопротекторным действием, препятствуя развитию эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете II типа [9].

Учитывая лидирующие позиции сосудистых осложнений в структуре инвалидности и смертности пациентов с сахарным диабетом, ключевую роль поражений микроциркуляторного русла в качестве начального этапа развития диабетических ангиопатий, а также перспективы применения лираглутида для совершенствования терапевтической коррекции гипергликемии, значительный научный и практический интерес представляет исследование ангиотроп-ных эффектов препарата и их зависимость от используемой дозы.

Цель — исследовать действие агониста рецепторов глюкагоноподобного пептида-1 — лираглути-

да — на микроциркуляцию в условиях аллоксановой инсулиновой недостаточности у белых крыс в зависимости от применяемой дозы препарата.

Материал и методы. Эксперимент был выполнен на 70 белых крысах, разделенных случайным образом на следующие группы: 1) контрольная — 20 интактных животных; 2) группа сравнения — 20 животных с аллоксановой инсулиновой недостаточностью; 3) опытная группа № 1 — 10 животных, которым на фоне экспериментального диабета вводили лираглутид в дозировке 0,2 мг/кг/сутки, 4) опытная группа № 2 — 20 животных, получавших инъекции лираглутида в дозировке 0,4 мг/кг/сутки на фоне экспериментального диабета. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Проведенные исследования соответствовали положениям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, требованиям национального руководства по содержанию и уходу за лабораторными животными и одобрены этическим комитетом Саратовского ГМУ имени В. И. Разумовского (протокол № 1 от 5 февраля 2019 г.). Экспериментальную инсулиновую недостаточность у животных моделировали подкожным введением 5%-го раствора аллоксана в 0,9%-м растворе NaCl из расчета l0oмг/кг массы тела животного [10].

Анализ современной литературы показывает возможность применения у крыс двух дозировок лираглутида — 0,2 и 0,4 мг/кг/сутки [11], поэтому коррекцию нарушений углеводного обмена и микроциркуляции осуществляли подкожным введением лираглутида с 21-х по 42-е сутки эксперимента в дозировках 0,2 и 0,4 мг/кг/сутки.

Выраженность нарушений углеводного обмена у крыс интактной группы, группы сравнения и опытных групп оценивали натощак по уровню глюкозы крови, определяемой портативным глюкометром Accu-Chek Performa Nano (Roche Diagnostics, Швейцария) и концентрации HbA1c в крови с использованием реактивов фирмы Diagnostic Systems GmbH (Германия) на анализаторе Sapphire 400 (Hirose Electronic System, Япония).

Для исследования параметров микроциркуляции применяли метод ЛДФ с использованием анализатора «ЛАКК-ОП» (НПП «Лазма», Россия). Регистрацию ЛДФ-грамм осуществляли на 42-е сутки эксперимента у всех групп животных на коже тыльной поверхности стопы. Определяли показатель перфузии в перфузионных единицах. С помощью вейвлет-ана-лиза определяли нормированные амплитуды эндотелиальных, нейрогенных, миогенных, дыхательных и сердечных колебаний.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных производили с помощью программы «Statistica 10» (StatSoft, США). Проводили проверку нормальности распределения полученных данных с помощью W -критерия Шапиро — Уилка. Большинство полученных данных не соответствуют закону нормального распределения. В связи с этим проводили расчет медианы (Me), верхнего и нижнего квартилей (Q1; Q3), а для сравнения групп между собой использовали непараметрический U -критерий Манна — Уитни. Критический уровень р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Результаты. В ходе проведенных исследований у животных группы сравнения обнаружено значимое увеличение концентраций глюкозы натощак и гликированного гемоглобина по сравнению с таковыми

Рис. 1. Изменение показателей углеводного обмена у крыс при курсовом введении лираглутида на фоне абсолютной инсулиновой недостаточности. Статистически значимые различия обозначаются: звездой — по сравнению с контролем, треугольником — по сравнению с группой сравнения, прямоугольником — по сравнению с дозировкой 0,2мг/кг/сутки: СД — сахарный диабет

у контрольных животных, что верифицировало развитие аллоксанового диабета (рис. 1).

У животных опытной группы № 1 лираглутид, применяемый в дозе 0,2 мг/кг/сутки в течение 21 суток (в период с 21-х по 42-е сутки эксперимента), достоверно снижал уровень глюкозы в крови натощак на 52% относительно группы сравнения, однако значения оставались выше контрольных. Концентрация гликированного гемоглобина в крови у крыс этой опытной группы на 42-е сутки эксперимента была на 23% ниже, чем у крыс группы сравнения, но на 28% выше контрольных значений.

Уровень глюкозы в крови натощак на 42-е сутки эксперимента у животных опытной группы № 2, которым лираглутид вводили в дозе 0,4 мг/кг/сутки, был в 3 раза ниже относительно значений группы сравнения и не имел статистически значимой разницы с контрольной группой. Концентрация гликированного гемоглобина у данных животных на 42-е сутки эксперимента была на 53% ниже, чем у крыс с аллоксановым диабетом, и статистически значимо не отличалась от контроля.

При сравнении двух опытных групп между собой установлено, что при введении препарата в дозировке 0,4 мг/кг/сутки уровень глюкозы натощак на 42-е сутки эксперимента на 30% ниже, чем при дозировке 0,2 мг/кг/сутки. При этом концентрация гликированного гемоглобина также достоверно ниже значений группы с меньшей дозировкой препарата.

Из этого можно заключить, что введение лира-глутида белым крысам с абсолютной инсулиновой недостаточностью в течение 21 суток в дозировке 0,2 мг/кг/сутки позволяет добиться частичной нормализации углеводного обмена. В то же время увеличение дозы лираглутида до 0,4 мг/кг/сутки приводит к полной нормализации уровней глюкозы и гликированного гемоглобина у животных с аллоксановым диабетом.

При оценке состояния микроциркуляторного русла установлено, что у животных группы сравнения на 42-е сутки эксперимента наблюдалось статистически значимое снижение перфузионного показате-

Перф.ед.

Показатель перфузии

■ Контроль                           ■ Группа сравнения (СД)

■ СД + лираглутид 0,2 мг/кг/сутки        ■ СД + лираглутид 0,4 мг/кг/сутки

Рис. 2. Изменение перфузии кожи тыльной поверхности стопы у крыс при курсовом введении лираглутида на фоне абсолютной инсулиновой недостаточности. Статистически значимые различия обозначаются: звездой — по сравнению с контролем, треугольником — по сравнению с группой сравнения, прямоугольником — по сравнению с дозировкой 0,2 мг/кг/сутки ля по сравнению с животными в контрольной группе, свидетельствующее о редукции тканевого кровотока (рис. 2).

У животных опытной группы № 1 при введении лираглутида в дозе 0,2 мг/кг/сутки на фоне инсулиновой недостаточности к 42-м суткам эксперимента наблюдалось повышение перфузионного показателя на 26% ( р <0,001) относительно группы сравнения. Показатель перфузии в данной группе не имел статистически значимых различий со значениями контрольной группы, что свидетельствовало об улучшении состояния микрокровотока.

При введении лираглутида в дозе 0,4 мг/кг/сутки у животных опытной группы № 2 перфузионный показатель был на 34% выше ( р <0,001), чем в группе сравнения, и полностью восстанавливался до уровня контрольной группы.

Изменение нормированных амплитуд колебаний кровотока у животных при введении лираглутида на фоне экспериментального диабета, (Ме (Q25; Q75)

Показатели	Контроль ( n =20)	Группа сравнения (диабет) ( n =20)	Опытная группа (диабет + лираглутид 0,2 мг/кг/сутки) ( n =10)	Опытная группа (диабет + лираглутид 0,4 мг/кг/сутки) ( n =20)
Амплитуда эндотелиальных колебаний, усл. ед.	17,7 (14,0; 20,0)	9,5 (8,5; 10,9) p 1= 0,002	11,7 (7,8; 12,5) p = 0,017 p 12=0,438	18,3 (12,8; 23,5) p =0,583 p 1=0,001 р 23=0,003
Амплитуда нейрогенных колебаний, усл. ед.	11,2 (10,3; 14,3)	10,0 (7,7; 11,3) p 1=0,043	13,2 (8,6; 13,9) p = 0,859 p 12=0,095	9,7 (7,2; 12,3) p =0,074 p 1=0,785 р 23=0,180
Амплитуда миогенных колебаний, усл. ед.	10,3 (9,9; 10,5)	10,3 (8,0; 12,2) p 1=0,905	9,4 (8,5; 13,9) p =0,929 p 1=0,905	9,2 (5,8; 11,5) p =0,303 p 1=0,265 р 2=0,319

Примечание: p ₁ — уровень значимости по сравнению с контролем, p ₂— уровень значимости относительно группы сравнения, р ₃— уровень значимости по сравнению с дозой лираглутида 0,2 мг/кг/сутки.

С помощью вейвлет-анализа ЛДФ-грамм установлено, что снижение кровотока в группе животных с аллоксановой инсулиновой недостаточностью сопровождалось перераспределением вклада активных механизмов модуляции микроциркуляции. Нормированные амплитуды эндотелиальных и нейрогенных колебаний на 42-е сутки эксперимента были достоверно ниже контрольных значений. Значения амплитуды миогенных колебаний статистически значимо не изменялись (таблица).

Установлено также, что восстановление показателя перфузии у животных опытной группы № 1, у которых лираглутид применяли в дозировке 0,2 мг/кг/сутки, происходило преимущественно за счет увеличения амплитуд эндотелиальных колебаний на 23,2% ( p =0,438) по отношению к группе сравнения. Нейрогенные колебания при использовании указанной дозировки не имели статистической разницы с контрольной группой. Наряду с этим при использовании дозировки 0,4 мг/кг/сутки амплитуда эндотелиальных колебаний у животных опытной группы № 2 увеличивалась относительно группы сравнения на 92,6% ( р =0,001).

При сравнении опытных групп между собой выявлено, что при использовании лираглутида в дозировке 0,4 мг/кг/сутки показатель перфузии кожи тыльной поверхности стопы у крыс с аллоксановой недостаточностью инсулина на 7% ( р =0,012) выше, чем при использовании дозировки лираглутида 0,2 мг/кг/сутки (рис. 2). При этом амплитуды эндотелиальных осцилляций также статистически значимо выше в группе животных с большей дозировкой препарата, а амплитуды нейрогенных колебаний не имели существенной разницы между опытными группами с разной дозировкой препарата (таблица).

Таким образом, полученные данные подтверждают то, что курсовое введение лираглутида с 21-х суток эксперимента в дозировке 0,2 мг/кг/сутки значительно улучшает перфузию кожи тыльной поверхности стопы, преимущественно за счет стимуляции эндотелий-зависимой вазодилатации и снижения нейрогенного тонуса прекапиллярного звена микро-циркуляторного русла. Курсовое введение лираглу-тида в дозировке 0,4 мг/кг/сутки наиболее эффективно корректирует развитие микроциркуляторных нарушений у белых крыс с аллоксановым диабетом, что проявляется большей степенью увеличения перфузии кожи тыльной поверхности стопы и эндоте- лий-зависимой вазодилатации по сравнению с курсом введения меньшей дозы.

Обсуждение. В ходе эксперимента с помощью ЛДФ обнаружено, что введение аллоксана приводит к статистически значимому снижению перфузионного показателя, а также нормированных амплитуд эндотелиальных и нейрогенных колебаний на 42-е сутки эксперимента. Это согласуется с данными предыдущих исследований, свидетельствующих о том, что редукция тканевого кровотока при аллоксановой недостаточности инсулина ассоциирована со снижением эндотелий-зависимой вазодилатации и повышением нейрогенного тонуса [12].

Целостность и функция эндотелия имеют решающее значение для тонической регуляции кровотока, в первую очередь за счет высвобождения сосудосуживающих и сосудорасширяющих факторов, которые изменяют просвет сосудов, что определяет локальный сосудистый тонус в каждом сегменте. Нарушение эндотелий-зависимой релаксации является характерной клинической особенностью эндотелиальной дисфункции, которая наблюдалась в экспериментальных моделях сахарного диабета [13].

Альтерирующее влияние на эндотелий оказывает хроническая гипергликемия, важным механизмом которой является активация протеинкиназы С, что приводит к запуску многочисленных внутриклеточных сигнальных механизмов, которые вызывают увеличение проницаемости сосудистой стенки, нарушение эндотелий-зависимой дилатации сосудов, подавляя активность растворимой гуанилатциклазы — фермента, с помощью которого NO реализует свои эффекты, в частности вазорелаксацию [14]. При этом важную роль в патогенезе сосудистых осложнений сахарного диабета занимает активации окислительного стресса — дисбаланс прооксидантов и антиокислителей, приводящий к накоплению высокотоксичных продуктов свободнорадикального окисления, что, в свою очередь, ведет к развитию и прогрессированию эндотелиальной дисфункции [15].

Результаты клинических исследований ангиопро-текторного действия лираглутида в настоящее время продемонстрированы только у пациентов со вторым типом сахарного диабета и не являются однозначными. Так, было обнаружено улучшение эндотелий-зависимой вазодилатации у пациентов с сахарным диабетом II типа под влиянием лираглутида [9]. Данные других авторов указывают на то, что терапия лираглутидом не оказывает существенного влияния ни на коронарную, ни на периферическую микро-сосудистую функцию у пациентов с сахарным диабетом II типа [16]. Противоречивость приведенных литературных данных обусловливает необходимость дальнейших исследований характера и механизмов ангиопротекторных эффектов лираглутида при диабете.

В экспериментах in vitro продемонстрированы определенные биологические эффекты, возникающие в результате влияния ГПП-1 на эндотелий сосудов. Так, воздействие лираглутидом на эндотелиальные клетки приводит к увеличению продукции NO и значимому снижению уровня окислительного стресса [17]. Положительные эффекты влияния на эндотелий сосудов подтверждаются данными исследований in vivo . В частности, внутривенное введение самцам крыс нативного ГПП-1 в течение 2 ч сопровождалось значимым улучшением микрокровотока, подтвержденное ультразвуковым методом [18], что указывает на наличие непосредственного воздействия инкретинов на сосудистый тонус за счет индукции эндотелий-зависимой вазодилатации. Следует отметить, что на модели артериальной гипертонии у мышей аналоги глюкагоноподобного пептида снижают артериальное давление и оказывают эндо-телий-протекторное действие независимо от уровня гликемии [18]. Следовательно, выявленные в ходе настоящего исследования положительные эффекты лираглутида на микроциркуляцию могут быть связаны с нормализацией углеводного обмена, что предотвращает дальнейшую альтерацию эндотелиальных клеток [17], либо с прямым эндотелий-протекторным действием данного препарата [18].

Согласно полученным данным, эффект лираглу-тида на перфузию микроциркуляторного русла зависит от дозы. Зависимость от дозы лираглутида также характерна для процесса восстановления амплитуды эндотелиальных колебаний и не характерна для нейрогенных колебаний, что указывает на чувствительность механизма эндотелий-зависимой дилатации к концентрации в кровотоке аналога ГГП-1. Следует отметить, что повышение амплитуды эндотелиальных колебаний указывает на увеличение продукции эндотелиоцитами эндогенного вазодилататора — оксида азота [19]. С одной стороны, это может быть обусловлено непосредственным влиянием лираглу-тида на эндотелий-зависимую дилатацию (увеличение прямого дилатирующего эффекта с увеличением дозы), с другой — больший эффект дозировки 0,4 мг/кг/сутки ассоциирован с полной нормализацией углеводного обмена, что предполагает выраженное уменьшение альтерации эндотелия гипергликемией. Ранее продемонстрированные результаты свидетельствуют о том, что лираглутид при применении в двух дозировках — 0,2 и 0,4 мг/кг/сутки — повышает сниженную концентрацию метаболитов оксида азота у крыс с сахарным диабетом. Это может расцениваться как восстановление продукции этого вазодилататора [11]. Показано, что лираглутид в определенных дозировках способен оказывать различное влияние на показатели углеводного обмена и липидный профиль. Однако значимых различий интенсивности повышения сывороточной концентрации метаболитов NO у крыс с сахарным диабетом при использовании указанных дозировок авторы не обнаружили. Следует отметить, что концентрация метаболитов NO в сыворотке представляет собой результирующую активность разных изоформ NO-синтазы и не коррелирует непосредственно с эн- дотелий-зависимой вазодилатацией. В частности, при заболеваниях сердечно-сосудистой системы развивающаяся дисфункция эндотелия ассоциирована с повышением уровня нитритов в кровотоке за счет активности индуцибельной формы NО-синтазы [20]. Таким образом, представленные результаты настоящего исследования уточняют характер реакций нитроксидэргической системы на введение лираглу-тида и указывают на зависимость активации эндотелиальной изоформы NO-синтазы от используемой дозировки.

Заключение. Результаты исследования позволяют заключить, что курс введения лираглутида вызывает восстановление микроциркуляции у крыс с аллоксановым диабетом дозозависимым образом, повышая перфузию кожи тыльной поверхности стопы относительно группы сравнения на 2б% при использовании дозы 0,2 мг/кг и на 34% — при применении дозы 0,4 мг/кг. Нормализация микроциркуляции под действием лираглутида осуществляется за счет стимуляции эндотелий-зависимой вазодилатации и снижения тонуса прекапиллярного звена микро-циркуляторного русла. Зависимость эффекта от дозировки лираглутида определяется различной интенсивностью восстановления эндотелий-зависимой вазодилатации. Между тем восстановление нейрогенного тонуса одинаково выражено при использовании указанных дозировок.

Полученные данные, характеризующие эндоте-лий-протекторные эффекты лираглутида, подтверждают целесообразность его применения у пациентов с сахарным диабетом для предотвращения развития и прогрессирования эндотелиальной дисфункции.