Влияние фетальных костномозговых мезенхимальных клеток на течение хронического пиелонефрита у крыс

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ УРОЛОГИЯ №4 2010

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ УРОЛОГИЯ №4 2010

Таблица 4. Изменения в общем анализе мочи у крыс с индуцированным хроническим пиелонефритом в разные сроки после ведения физиологического раствора.

Показатели До пересадки Через 2 недели Через 1 месяц Через 1,5 месяца Прозрачность Мутная (100%) Сл. мутная (20%) Мутная (80%) Мутная (100%) Сл. мутная (20%) Мутная (80%) Относительная плотность 1026 ± 4 1018 ± 3 1021 ± 4 1014 ± 3 рН 7,1 ± 0,1 7,0 ± 0,1 7,6 ± 0,1* 7,8 ± 0,1* Белок (г/л) 3,2 ± 0,3 2,9 ± 0,2 3,4 ± 0,2 3,6 ± 0,2 Эпителий плоский Умеренное количество (100%) Умеренное количество (60%) Значительное количество (40%) Умеренное количество (40%) Значительное количество (60%) Умеренное количество (80%) Значительное количество (20%) Лейкоциты (кл. в п./зр.) 39,6 ± 6,2 46,1 ± 4,1 44,2 ± 8,2 38,3 ± 5,1 Эритроциты (кл. в п./зр.) 9,1 ± 3,3 19,8 ± 9,4 15,6 ± 5,8 21,8 ± 11,9 Бактерии +++ (100%) +++ (100%) +++ (100%) +++ (100%) Соли Значительное количество (100%) Значительное количество (80%) Умеренное количество (20%) Значительное количество (80%) Умеренное количество (20%) Значительное количество (100%) Примечание: достоверность различий по отношению к крысам до введения физ. раствора * – p<0,05. кальцификация некротизированных эпителиоцитов) (рисунок 1). То есть, выявленные изменения полностью соответствуют картине хронического пиелонефрита.

За время наблюдения в опытной серии (1-я серия) все животные выжили, тогда как в контрольной серии (2-я серия) умерло 2 крысы (1 – через 2 недели и 1 – через 2 месяца) от прогрессирующей почечной недостаточности (летальность 16%).

В 1-й серии опытов в общем анализе мочи после пересадки клеток у большинства животных по ряду показателей выявлялась положительная динамика. В частности, уменьшалась мутность мочи, уменьшался рН мочи, сдвигаясь из нейтральных или щелочных значений в кислую сторону, достоверно уменьшалась протеинурия (таблица 3). В осадке мочи через 2 недели отмечалось снижение лейкоциту-рии, однако в более поздние сроки количество лейкоцитов снова нарастало, практически достигая исходных значений. Бактериурия у большинства животных сохранялась на прежнем уровне и лишь у 20% уменьшалась. Интересным фактом явилось уменьшение содержания солевого осадка мочи, особенно выраженное спустя 1,5 месяца после введения КМ-МСК.

Во 2-й серии (контрольной) в общем анализе мочи существенных изменений не происходило (таблица 4). Сохранялась высокая мутность мочи, сдвиг рН в щелочную сторону возрастал, протеинурия не уменьшалась, лейкоциту-рия и бактериурия сохранялись на прежнем уровне.

При оценке функциональных параметров у всех крыс опытной серии отмечено достоверное улучшение основных показателей функционального состояния почек. Если динамика концентрации креатинина крови в обеих группах была практически одинаковой, то уровень мочевины крови после введения КМ-МСК был более стабильным и ближе к нормальным значениям, чем в контрольной серии, особенно при поздних сроках наблюдения (рисунок 2).

Клиренс креатинина в опытах с КМ-МСК постепенно возрастал, достигая нормальных значений к 1,5 месяцам, но позднее имел тенденцию к снижению, оставаясь к концу срока наблюдения все же выше исходных значений (рисунок 3А). В контрольной серии после кратковременного улучшения клиренс креатинина прогрессивно снижался и через 3-4 месяца был ниже исходных значений и достоверно ниже, чем в опытах с введением КМ-МСК. Канальцевая реабсорбция натрия

Рисунок 2. Динамика концентрации креатинина (А) и мочевины (Б) в крови крыс с хроническим пиелонефритом после интрапаренхиматозного введения КМ-МСК в сравнении с контролем.

в опытах с введением КМ-МСК постепенно возрастала, достигая максимальных значений через 1-2 месяца (рисунок 3Б). В конце срока наблюдения (3-4 месяца) этот показатель существенно снижался, достигая субнормальных значений. В контрольной серии реабсорбция натрия в первые 2 недели возрастала, но потом отмечался период снижения и стабилизации на значениях, более a

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ УРОЛОГИЯ №4 2010

Рисунок 3. Динамика клиренса креатинина (А), реабсорбции натрия (Б) и реабсорбции кальция (В) у крыс с хроническим пиелонефритом после интрапаренхиматозного введения КМ-МСК в сравнении с контролем.

Рисунок 4. Почка крысы с хроническим пиелонефритом через 3 месяца после введения КМ-МСК.

А – склероз и умеренная клеточная инфильтрация интерстиция, деформированные почечные канальцы, частично заполненные эозинофильным содержимым. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200х.

Б – относительно сохранная паренхима. Очаговая лимфогистиоци-тарная инфильтрация интерстиция. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200х.

Рисунок 5. Почка крысы с хроническим пиелонефритом через 3 месяца поле введения КМ-МСК.

А – выраженная лимфогистиоци-тарная инфильтрация подслизистого слоя почечной лоханки. Относительно сохранные прилежащие почечные канальцы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200х.

Б – выраженный склероз и клеточная инфильтрация подслизистого слоя. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200х.

низких, чем в группе с введением КМ-МСК. Реабсорбция кальция в почечных канальцах в серии опытов с введением КМ-МСК во все сроки наблюдения была выше, чем в контрольной серии (рисунок 3В).

Гистологическое исследование почек проведенное через 3 месяца после введения стволовых клеток показало, что выявляемые изменения достаточно гетерогенны. В одной и той же почке в разных участках выявляются зоны склероза с умеренной инфильтрацией лимфогистиоцитарными элементами. В этих участках выявляются как относительно сохранные клубочки, так и клубочки с разной степенью склерозирования. Большинство почечных канальцев расширено, деформировано, часть из них заполнена гомогенным эозинофильным содержимым. Эпителий отдельных почечных канальцев кальцифицирован (рисунок 4А). В то же время встречаются участки с относительно сохранной паренхимой и лишь диффузно-очаговой инфильтрацией интерстициального пространства лимфомононуклеарными элементами. Большинство клубочков и канальцев в этих участках мало изменены, и лишь отдельные канальцы расширены, но не имеют белкового содержимого (рисунок 4Б). В некоторых почках выявлялись только морфологические признаки пиелита без выраженных воспалительных изменений прилежащей паренхимы почки. На рисунке 5А видна выраженная лейкоцитарная инфильтрация подслизистого слоя почечной лоханки, затрагивающая лишь прилежащие к нему почечные канальцы, тогда как в более отдаленной зоне инфильтративных изменений не выявлено. В других экспериментах выявлялся выраженный склероз подслизистого слоя почечной лоханки, как следствие длительно текущего воспалительного процесса, и его массивная лимфогистиоцитарная инфильтрация (рисунок 5Б).

Оценка параметров гуморального иммунитета выявила уменьшение уровня иммуноглобулина G (IgG) и С3-компонента комплемента в крови крыс с хроническим пиелонефритом. Введение КМ-МСК способствовало нормализации этих показателей и возрастание содержания IgM (таблица 5).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ УРОЛОГИЯ №4 2010

Таблица 5. Изменения показателей гуморального иммунитета у крыс с хроническим пиелонефритом после введения КМ-МСК (г/л).

Показатель	Интактные крысы	Крысы с хроническим пиелонефритом	Крысы с хроническим пиелонефритом + КМ-МСК
IgA	0	0,1 ± 0,1	0
IgG	5,34 ± 0,54	3,99 ± 0,23*	6,18 ± 0,69
IgM	0,40 ± 0,03	0,43 ± 0,02	0,56 ± 0,4*
C 3	0,88 ± 0,06	0,62 ± 0,04*	0,81 ± 0,05
C 4	0,11 ± 0,1	0,11 ± 0,1	0,12 ± 0,1
Примечание: * – достоверность разницы результатов по сравнению с контролем – p < 0,05.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами данные свидетельствуют, что введенные в пиелонефритическую почку КМ-МСК, приводят к кратковременному (2 недели) уменьшению признаков, характеризующих выраженность воспалительного процесса (лейкоцитурия, бакте-риурия), но при этом вызывают длительное улучшение функционального состояния поврежденного органа (ацидификация мочи, уменьшение протеинурии, улучшение азотовыделительной функции почек, фильтрационной функции клубочков и канальцевой реабсорбции). По всей видимости, КМ-МСК, не оказывая прямого действия на возбудитель, вызвавший пиелонефрит, уменьшают выраженность воспалительной реакции и сглаживают негативные последствия длительно текущего воспаления. Механизм их действия точно не установлен, но ряд авторов его связывают с иммуномодулирующими свойствами этих клеток и их способностью секретировать комплекс противовоспалительных цитокинов и факторов роста [7, 10, 16]. Отмечают способность МСК подавлять пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, дендритных клеток и цитотоксических NK-клеток, а также секрецию ими провоспалительных цитокинов [13, 17], что оказывает иммуносупрессивный эффект и подавляет аутоиммунный компонент хронического воспаления [11]. В то же время имеются указания, что неактивированные МСК не оказыва- ют иммуносупрессивного эффекта и для его проявления необходима активация этих клеток митогенами (конкавалина А в высокой дозе, супернатант культуры активированных лимфоцитов) или комплексом провоспалительных цитокинов (интерферон-γ + фактор некроза опухолей-α + интерлейкин-1α или β) [18, 19]. Исходя из этих данных, складывается представление, что терапевтическое действие КМ-МСК при хроническом пиелонефрите может реализоваться следующим образом. Инъецированные в почку КМ-МСК активируются комплексом провоспалительных цитокинов, выделяемых стромальными клетками почки в ответ на действие бактериального агента (а возможно, и бактериальным эндотоксином), что ведет к секреции ими комплекса цитокинов с противовоспалительным действием и факторов роста, которые, с одной стороны, способствуют уменьшению выраженности воспалительной реакции и вызываемого ею клеточного повреждения, а с другой стороны, стимулирует регенерацию поврежденных клеточных структур. Подавление пролиферации активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток с цитотоксическим действием препятствует дальнейшему повреждению паренхимы органа. Именно действие этих факторов способствует сохранению или улучшению функционального состояния почки, несмотря на персистенцию микробного агента в паренхиме органа.

Изменения показателей гуморального иммунитета свидетель- ствуют о повышенном расходовании С3-компонента комплемента в иммунных реакциях с цитотоксическим эффектом и уменьшении концентрации IgG, участвующих во вторичном иммунном ответе и нейтрализации эндотоксинов, в крови крыс с хроническим пиелонефритом. С3-компонент комплемента является ключевым звеном в каскаде иммунологических реакций, приводящих к образованию мембраноатакующего комплекса, способного при взаимодействии с клеткой-мишенью вызвать ее лизис. Уменьшение концентрации IgG в крови также может свидетельствовать о повышенном его расходовании в реакциях, связанных с активаций С3-комплемента и нейтрализации бактериальных эндотоксинов. Дефицит IgG ослабляет вторичный иммунный ответ и может способствовать персистенции воспалительного процесса. Введение КМ-МСК способствовало нормализации этих показателей, что может служить свидетельством уменьшения аль-теративного эффекта хронической воспалительной реакции и восстановления защитных возможностей гуморального звена иммунитета.

Проведенное нами гистологическое исследование через 3 месяца после введения КМ-МСК в пие-лонефритическую почку выявило гетерогенную картину. Наряду с участками с выраженным склерозированием ткани и дегенерацией клубочков и канальцев выявляли зоны, где воспалительные изменения и склероз были вы- a

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ УРОЛОГИЯ №4 2010 ражены в минимальной степени. По-видимому, эта гетерогенность может быть объяснена ограниченной способностью к миграции введенных в почку КМ-МСК от места инъекции, поскольку выделяемые клетками гуморальные факторы действуют лишь в ближайшем окружении. Кроме того, в отдельных участках дегенеративные изменения могут перейти в необратимую фазу с полным замещением функциональных структур соединительной тканью еще до введения КМ-МСК, что, конечно, исключает возможность восстановления нормальной тканевой структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ