Влияние гранулированного препарата на основе сабельника болотного на адаптационный резерв высокопродуктивных коров при оксидативном стрессе

Введение. Промышленное животноводство характеризуется интенсивной технологией содержания, для которой характерны высокие технологические нагрузки, направленные на достижение максимальной продуктивности. Подобные условия зачастую являются источником технологического стресса, активируя гипоталамо-гипофи-зарно-надпочечниковую ось. Глюкокортикоиды занимают центральное место в гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системе, которая адаптирует организм к изменяющимся условиям среды, мобилизуя энергетические ресурсы и регулируя метаболические процессы [1–3].

Глюкокортикоиды способствуют активации перекисного окисления липидов с образованием избытка свободных радикалов, что в конечном итоге является ключевым механизмом развития окислительного стресса [4, 5].

Перекисное окисление липидов является основной причиной нарушения клеточных структур, снижения клеточного энергообеспечения и антиоксидантной защиты за счет стресс-индуцированного угнетения процессов синтеза ферментов антиоксидантной системы и их активности.

Установлено, что при стрессе происходит снижение уровня гемоглобина и эритроцитов, что вызывает вторичную тканевую гипоксию, накопление лактата и развитие ацидоза в условиях активирующегося гликолиза. Повышение проницаемости лизосомальных мембран и активация лизосомальных ферментов, в свою очередь, способствуют деструкции клеточных структур и снижению активности ферментов, угнетая антиоксидантную защиту [6].

Нарушения в клеточных структурах, вызванные интенсификацией свободнорадикального окисления ключевых биомолекул (липидов, нуклеиновых кислот, белков), формируют основу для развития многих патологических состояний [5–7].

Противодействует свободнорадикальному окислению эндогенная антиоксидантная система, включающая в себя широкий класс соединений: антиоксидантные ферменты, альбумины, свободные жирные кислоты, комплексоны ионов металлов, витамины и не включенные в перечисленные группы низкомолекулярные соединения, образующие редокс-буфер [4, 5].

Основным плазменным белком с антиокси-  стью, окисляя двухвалентное железо до трехва- дантной активностью является церулоплазмин лентного по схеме

[4, 8, 9]. Он обладает ферроксидазной активно-

Fe2+ ↔ Fe3+ → трансферрин → синтез гема → гемоглобин

Трехвалентное железо (Fe3+) встраивается в молекулу апотрансферрина, образуя трансферрин. Этот комплекс переносит железо в костный мозг для синтеза гема. Установлено, что благодаря ферроксидазной активности церулоплазмин обладает не только антиоксидантной активностью, но и играет ключевую роль в процессе кроветворения и кислородтранспортной функции [9].

Также церулоплазмин обладает активностью супероксидисмутазы, купроксидазы, катализирующей окисление Cu+, NO-оксидазы и глутати-он-связанной пероксидазы, активно препятствуя образованию свободных радикалов [4, 8, 9]. Согласно анализу литературных источников, препараты церулоплазмина проявляют также иммуномодулирующее действие [9]. Совокупность ферроксидазной, антиоксидантной и иммуномодулирующей активности позволяет рассматривать эндогенный церулоплазмин как интегральный маркер адаптационного резерва организма.

Для прерывания стресс-индуцированного каскада свободнорадикального окисления требуются дополнительные экзогенные средства, снижающие радикальную нагрузку на эндогенные антиоксидантные системы. К таким относятся средства, нормализующие энергетический обмен, стабилизирующие клеточные мембраны и активизирующие синтез макромолекулярных и надмолекулярных структур [7]. В частности, к ним относятся многие препараты растительного происхождения. Установлено, что препараты на основе сабельника болотного за счет полифе-нольных соединений подавляют процессы свободнорадикального окисления и стимулируют эндогенную антиоксидантную систему [10,11]. Сухой экстракт сабельника болотного является истинным иммуномодулятором, поскольку проявляет иммуномодулирующее действие только в условиях сниженного иммунитета [12].

Полифенолы, в связи с быстрой метаболической трансформацией в организме, не способны проявить полноту своего биологического действия [13]. Установлено, что аскорбиновая кислота способствует сохранению полифеноль-ных соединений сабельника [14].

Поиск растительного сырья, содержащего большое количество витамина С, показал, что таким сырьем является клюква болотная: содержание этого витамина составляет около 12– 20 мг% [15].

Клюква вводится в рецептуру препарата как полифункциональный компонент. Во-первых, витамин С этих ягод обеспечивает синергизм с полифенолами сабельника, повышая антиоксидантный статус предлагаемого препарата. Во-вторых, клюква, применяемая как поливитаминное средство [16], обогащает препарат дополнительными микронутриентами, что расширяет спектр фармакологического действия полученного препарата. Основное фармакологическое действие клюквы связано с содержанием в ягодах проантоцианидинов и флавоноидов. Антоцианы клюквы проявляют антиоксидантное действие и способствуют синтезу белка [17, 18].

В качестве оптимальной формы препарата на основе сабельника и клюквы была выбрана гранулированная форма как наиболее подходящая для использования при автоматизации технологических процессов [19].

Терапия антиоксидантными препаратами способствует торможению процессов оксида-тивного стресса, но не устраняет уже образовавшиеся повреждения клеточных структур. Для структурного восстановления этих повреждений в современной практике предлагают использовать фосфолипиды, которые способны встраиваться в поврежденные участки мембран клетки [20, 21].

В качестве связующего компонента для придания эластичности растительным гранулам был выбран подсолнечный лецитин [22], что связано не только с его технологическим эффектом, но и рядом фармакотерапевтических свойств. Подсолнечный лецитин проявляет ан-тисвободорадикальное действие, способствует снижению уровня холестерина и абсорбции жирорастворимых витаминов, а также образованию активных форм витаминов В [23]. Также в научных исследованиях М.В. Патшиной с соавторами было установлено, что лецитин способствует усилению биодоступности полифенолов [24].

Несмотря на имеющиеся обширные данные о свойствах сабельника, клюквы и лецитина, влияние их комплексного применения в гранулированной форме на уровень церулоплазмина и интегральные показатели адаптационного статуса у высокопродуктивных коров в условиях промышленного комплекса ранее не было изучено.

Цель исследования – оценка влияния разработанного гранулированного препарата на уровень церулоплазмина и другие биохимические и гематологические показатели адаптации у высокопродуктивных коров.

Задачи: изучить влияние гранулированного препарата на уровень церулоплазмина и показатели обмена железа у коров, содержащихся в условиях промышленного комплекса; на соотношение кортизол/инсулин у высокопродуктивных коров в условиях промышленного стресса; на показатели лейкоцитарного профиля у коров, содержащихся в условиях промышленного комплекса; на показатели белково-липидного обмена у опытных коров.

Достижение поставленной цели было основано на гипотезе о том, что применение гранулированного препарата будет способствовать повышению уровня эндогенного церулоплазмина и улучшению показателей белково-липидного профиля и иммунного статуса у коров.

Объекты и методы. Работа была выполнена в период 2018–2024 гг. Экспериментальная часть проводилась на базе промышленного комплекса ООО «Маслово», аналитические исследования – на базе кафедры биотехнологии и химии имени профессора Н.Е. Павловской и в ИНИИ ЦКП ФГБОУ ВО Орловский ГАУ им. Н.В. Парахина.

Было изучено влияние скармливания дополнительно к основному рациону в течение 21 суток растительного гранулированного препарата из сабельника, клюквы и лецитина в дозе 2,15 г на 1 кг живой массы. Гранулированный препарат, состоящий из сабельника болотного, ягод клюквы и подсолнечного лецитина, был изготовлен по методике, зарегистрированной в нашем патенте РФ № 2844375.

Сабельник болотный и клюква дикорастущая были заготовлены на территории Республики Коми.

В качестве объекта эксперимента были выбраны коровы голштинизированной породы, содержащиеся в промышленных условиях ком- плекса ООО «Маслово». По принципу параналогов были сформированы две группы численностью по 10 голов каждая. Животные контрольной группы получали рацион, принятый в хозяйстве (ОРХ). Животные опытной группы дополнительно к ОРХ получали разработанный гранулированный препарат.

Для оценки состояния опытных животных анализировали кровь и сыворотку крови. Кровь для исследований отбирали у коров в утренние часы перед кормлением из яремной вены с соблюдением правил асептики и антисептики.

Уровень церулоплазмина у животных определяли с помощью экспресс-метода по Э.В. Тэну (1981). Уровень кортизола у коров определяли в лаборатории «Vet Union» (г. Москва).

В цельной крови на гематологическом анализаторе «DH36-Vet» определяли гематологические показатели.

Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны. Данные представлены в статье в виде M ± SD, где М – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение. Для оценки статистической значимости различий между показателями у коров сравниваемых групп использовали критерий Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Одним из основных показателей уровня свободнорадикального окисления является малоновый диальдегид (МДА). Как было показано нами ранее [25], исходно у животных обеих групп на 1-е сутки эксперимента значение малонового диальдегида (МДА) было выше нормы. К 21-м суткам опыта в крови коров опытной группы уровень МДА был в пределах нормы, при этом уровень МДА у животных контрольной группы оставался выше нормы. Снижение уровня МДА было сопряжено с положительной динамикой основного антиоксиданта крови – церулоплазмина.

В начале эксперимента уровни церулоплазмина и эритроцитов у всех животных были ниже нормы. У коров контрольной группы данное состояние сохранялось до конца опыта. Концентрация гемоглобина у коров контрольной и опытной групп в течение всего эксперимента сохранялась в пределах референтных значений, равных 90–115 г/л. Влияние гранулированного препарата на содержание церулоплазмина в крови коров опытной и контрольной групп представлено на рисунке 1.

Здесь и далее: * - р < 0,05, ** - р < 0,01 относительно контрольной группы коров, получавших только основной рацион.

Рис.1. Динамика церулоплазмина в сыворотке крови коров при применении гранулированного препарата

Dynamics of ceruloplasmin in the blood serum of cows with the use of a granular preparation

Как видно из рисунка 1, введение растительного гранулированного препарата на основе сабельника болотного, клюквы и подсолнечного лецитина дополнительно к основному рациону коров промышленного содержания положительно влияет на уровень церулоплазмина. К концу эксперимента концентрация церулоплазмина в сыворотке крови коров увеличилась на 34 % (р < 0,05) относительно коров контрольной группы, достигнув нормальных значений, равных 1,84-2,3 мкмоль/л.

Увеличение церулоплазмина в крови коров опытной группы, получавших дополнительно к основному рациону гранулированный препарат, сопровождалось повышением содержания эритроцитов до 6,8 ± 0,07 • 1012/л, т. е. было выше на 23 % (р < 0,05), чем в контроле, что соответствовало середине референтных значений, равных 5,5-8,5 • 1012/л. Также установлено повышение концентрации гемоглобина до (114,17 ± 0,51) г/л, что было на 10 % (р < 0,05) больше по сравнению с контролем. Стимуляция выработки эндогенного церулоплазмина приводит к улучшению кислородтранспортной функции у животных опытной группы.

Вышеперечисленные нарушения в морфобиохимических показателях, включая антиоксидантную систему, у коров в начале эксперимента проявлялись также в содержании кортизола.

На начало эксперимента концентрация кортизола в сыворотке крови коров двух групп приближалась к верхней границе референтного интервала (норма 26-90 нмоль/л); в контрольной группе уровень кортизола сохранялся на высоком уровне до окончания эксперимента. Влияние гранулированного препарата на данный показатель представлено на рисунке 2.

По данным рисунка 2, введение гранулированного препарата дополнительно к основному рациону способствовало снижению концентрации кортизола в крови коров опытной группы на 33 % (р < 0,05) относительно контроля.

Оценка стрессовой реакции только по уровню глюкокортикоидов может быть недостаточной, так как характер эндокринного ответа может меняться. В связи с этим в качестве более устойчивого маркера предлагается использовать соотношение кортизол/инсулин. Его повышение указывает на возрастание состояния напряжения и истощение адаптационного резерва [26, 27].

Согласно исследованиям С.С. Алексанина с соавт. [26], соотношение кортизол/инсулин оценивали по отношению к референтной медиане. Данная медиана была рассчитана как частное медиан референтных диапазонов для кортизола (нмоль/л) и инсулина (пмоль/л) и составила 0,6 [26].

Рис. 2. Динамика изменения уровня кортизола в сыворотке крови высокопродуктивных коров экспериментальных групп при использовании в кормлении гранулированного препарата Dynamics of cortisol level changes in serum of high-yielding cows during of the experimental groups when using a granular preparation

Опытная группа,       Опытная группа, препарат (1 сутки)     препарат (21 сутки)

К 21-м суткам опыта медиана значений индекса кортизол/инсулин у контрольной группы коров составила 1,1, что было выше рассчитанной референтной медианы. Это изменение указывает на снижение адаптационного резерва животных и состояние напряжения у них. Вели- чина индекса у контроля превышала рассчитанную референтную медиану в 1,8 раза. Изменение показателя кортизол/инсулин при скармливании гранулированного препарата показано на рисунке 3.

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

Контрольная группа (1 Контрольная группа (21 сутки)                    сутки)

Опытная группа, препарат (1 сутки)

vzzzzz 'ZZZZZZ vzzzzz vzcwz vzzzzz vzzzzz zzzzzz vzzzzz

Опытная группа, препарат (21 сутки)

Рис. 3. Динамика изменения индекса кортизол/инсулин (×103) в сыворотке крови высокопродуктивных коров при скармливании гранулированного препарата дополнительно к основному рациону Dynamics of the cortisol/insulin index (×0³) changes in the serum of high-yielding cows when fed a granular preparation in addition to the main diet

Согласно данным рисунка 3, введение допол-  тизол/инсулин был ниже контроля в 1,62 раза нительно к основному рациону коров гранулиро-  (p < 0,05) и приближался к рассчитанной рефе- ванного препарата привело к тому, что к 21-м сут рентной медиане, достигнув значения 0,68. эксперимента (концу эксперимента) индекс кор-

Таким образом, на фоне повышения эндогенного церулоплазмина в крови опытных коров произошла нормализация индекса корти-зол/инсулин, как одного из показателей адаптационного резерва.

Наблюдаемые нарушения исследуемых показателей у высокопродуктивных коров в усло- виях промышленного комплекса сопровождались изменениями в лейкоцитарной формуле, а именно нейтрофилезом и эозинопенией. Введение гранулированного препарата вызвало следующие положительные изменения лейкоцитарного профиля (рис. 4).

Контрольная группа (1 сутки) Контрольная группа (21 сутки) Опытная группа, препарат (1 Опытная группа, препарат (21 сутки)                         сутки)

□ Нейтрофилы, %  □ Базофилы, % s Эозинофилы, %  □ Моноциты, %  □Лимфоциты, %

Рис.4. Сравнительный анализ лейкоцитарной формулы крови коров, содержащихся в стрессогенных условиях промышленного комплекса Comparative analysis of the leukocyte formula of blood in cows kept under stress conditions of an industrial complex

Согласно анализу рисунка 4, в крови коров обеих групп в начале опыта содержание нейтрофилов было выше нормы (норма 30–36 %), в контрольной группе данный показатель оставался таковым на протяжении всего эксперимента. К 21-м сут эксперимента в опытной группе, получавшей дополнительно к основному рациону гранулированный препарат, количество нейтрофилов нормализовывалось и было ниже на 17 % (р < 0,05) относительно контрольной группы.

В первый день эксперимента было установлено, что уровень эозинофилов в контрольной и опытной группах был ниже референтных значений, равных 6–8 %, данное состояние сохранялось у животных контрольной группы на протяжении 21 сут опыта. Согласно научной литературе, снижение количества эозинофилов говорит об усилении работы коры надпочечников и увеличении функционального напряжения в организме [28–30]. При введении в рацион коров опытной группы гранулированного препарата из сабельника, клюквы и лецитина к концу эксперимента уровень эозинофилов достиг значений (6,40 ± 1,33) %, что соответствовало референтным значениям и было в 2 раза выше (р < 0,05), чем значения этих показателей у коров контрольной группы. Повышение уровня эозинофилов у коров опытной группы может косвенно указывать на снижение адаптационного напряжения в организме.

На начало эксперимента уровень лимфоцитов у коров обеих групп находился в пределах референтных значений, равных 40–65 %. При дополнительном введении в рацион опытной группы животных гранулированного препарата к концу эксперимента отмечалось повышение уровня данного показателя до (54,50 ± 2,33) %, что было выше на 6 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. По мнению Д.И. Березиной, это также может косвенно свидетельствовать о снижении синтеза кортикостероидов и повышении активности процессов адаптации [29].

Концентрация моноцитов в обеих группах находилась в пределах нормы на всем протяжении эксперимента. Однако к концу опыта у коров опытной группы было зафиксировано статистически значимое увеличение уровня моноцитов до значений (4,90 ± 1,45) %, что входило в пределы референтных значений. В контрольной группе уровень моноцитов, находясь в пределах нормы, к 21-м суткам имел тенденцию к снижению, что, вероятно, связано со стрессогенной технологией промышленного содержания, которую можно рассматривать как хронический стресс, вызывающий иммуносупрессивное действие на организм [30].

Таким образом, скармливание дополнительно к основному рациону коров гранулированного препарата на основе сабельника болотного, плодов клюквы дикорастущей и подсолнечного лецитина положительно отразилось на лейкоцитарном профиле у животных опытной группы, проявляя тем самым иммуномодулирующее действие.

При воздействии стресс-факторов и при адаптации к их длительному действию у сельскохозяйственных животных отмечаются изменения в белково-липидном обмене.

Содержание общего белка в крови коров контрольной группы на протяжении всего эксперимента находилось в пределах (69 ± 1,14) -*71,6 ± 1,92) г/л, а у опытной группы в его начале (69,1 ± 0,99) г/л. Содержание белка в обеих группах в начале эксперимента находилось у нижней границы референтного интервала, равного (72,0-86,0) г/л. Однако введение в рацион опытной группы гранулированного препарата привело к достоверному повышению данного показателя до уровня (83,7±1,05) г/л. По сравнению с контрольной группой уровень общего белка к концу эксперимента у коров, получавших препарат, был выше на 14 % (р < 0,05).

Концентрация мочевины была ниже нормы в крови коров контрольной группы и составила (1,5 ± 0,84) - (1,6 ± 2,12) ммоль/л на протяжении всего исследования, тогда как у коров опытной группы концентрация была ниже нормы только в начале эксперимента (1,61 ± 0,11) ммоль/л. На фоне применения гранулированного препарата в опытной группе было зафиксировано достоверное повышение данного показателя до (3,27 ± 0,18) ммоль/л. К 21-м суткам концентрация мочевины в опытной группе приблизилась к нижней границе рефе- рентного интервала и превышала показатель контрольной группы на 51 % (р < 0,05).

Содержание мочевой кислоты в крови коров контрольной и опытной групп на протяжении всего эксперимента находилось в пределах референтного интервала, равного 60-120 мкмоль/л. Однако введение в рацион опытной группы гранулированного препарата на основе сабельника, клюквы и лецитина привело к снижению данного показателя, который к концу эксперимента был равен (76 ± 1,41) мкмоль/л и стал на 32 % (р < 0,05) ниже, чем в контроле.

Исходно гиперхолестеринемия отмечалась и в контрольной (4,63 ± 1,0) ммоль/л, и опытной (4,8 ± 0,11) ммоль/л группах при норме 1,304,42 ммоль/л. В то время как у контрольных животных она сохранялась (4,78 ± 0,12) ммоль/л, применение гранулированного препарата привело к нормализации холестерина к концу опыта (3,2 ± 0,09) ммоль/л, при этом эти значения были на 33 % (р < 0,05) ниже, чем у коров контрольной группы.

На начало эксперимента в крови коров обеих групп содержание триглицеридов превышало референтные значения (норма 0,22-0,60 ммоль/л). У коров контрольной группы это состояние сохранялось в течение всего периода исследования. К 21-м суткам эксперимента уровень триглицеридов у опытных коров снизился до (0,5 ± 0,01) ммоль/л, что на 43 % (p < 0,05) ниже значений контрольной группы (0,88 ± 0,01 ммоль/л), в которой животные получали только основной рацион.

Таким образом, применение в течение 21 сут растительного гранулированного препарата на основе сабельника, клюквы и подсолнечного лецитина вызвало комплексную положительную динамику показателей липидного и белкового обменов. Наблюдаемое повышение общего белка и мочевины до уровня референтных значений на фоне одновременного снижения мочевой кислоты говорит об активации белкового синтеза и улучшении азотистого обмена. Одновременная коррекция показателей липидного обмена указывает на восстановление метаболического гомеостаза у коров за счет повышения адаптационного резерва животных в условиях промышленного стресса.

Заключение. Проведенное исследование позволило установить, что скармливание высокопродуктивным коровам в условиях промышленного комплекса гранулированного препарата на основе сабельника болотного, клюквы и подсолнечного лецитина в течение 21 суток оказывает комплексное адаптогенное действие. Гранулированный препарат стимулирует эндогенный синтез церулоплазмина и улучшает метаболизм железа, что подтверждается достоверным повышением количества эритроцитов и уровня гемоглобина. Применение препарата способствует повышению адаптационного резерва, оцененного по индексу кортизол/инсулин, и снижению уровня кортизола, что свидетельствует о повышении устойчивости организма к технологическому стрессу. В опытной группе зафиксировано повышение уровня общего белка и мочевины до физиологической нормы, а также коррекция липидного профиля (по холестерину и триглицеридам), что указывает на нормализацию показателей белково-липидного статуса. Гранулированный препарат проявляет иммуномодулирующую активность, выражающуюся в нормализации лейкоцитарной формулы.

Таким образом, разработанный гранулированный препарат является эффективным средством для коррекции стресс-индуцированных нарушений в морфобиохимических показателях, включая антиоксидантную систему, и повышения адаптационного потенциала высокопродуктивных коров в условиях промышленного содержания.